Ole vaila'au fa'ama'i ole N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ua lipotia mai e taofiofia le AChE (acetylcholinesterase) ma e iai ni mea e ono mafai ona maua ai le kanesa ona o le tele o le vascularization. I totonu o lenei pepa, matou te faʻaalia ai o le DEET e faʻamalosia faapitoa ai sela endothelial e faʻaleleia ai le angiogenesis, ma faʻateleina ai le tuputupu aʻe o le tuma. E fa'agaoioia e le DEET gaioiga feavea'i e tau atu i le angiogenesis, e aofia ai le fa'ateleina, femalaga'iga, ma le pipii. E fesoʻotaʻi lenei mea ma le faʻateleina ole gaosiga ole NO ma faʻamatalaga VEGF i sela endothelial. O le taofiofia o le M3 poʻo le faʻaaogaina o vailaʻau M3 inhibitors na faʻaumatia uma nei aʻafiaga, ma faʻaalia ai o le DEET-induced angiogenesis e M3-maaleale. O faʻataʻitaʻiga e aofia ai le faʻailoga o le calcium i le endothelial ma le HEK o loʻo faʻaalia ai le M3 receptors, faʻapea foʻi ma suʻesuʻega faʻapipiʻi ma faʻapipiʻi, e faʻaalia ai o le DEET o loʻo galue o se modulator allosteric o M3 receptors. E le gata i lea, o le DEET e faʻalavelaveina le AChE, ma faʻateleina ai le bioavailability o le acetylcholine ma lona fusia i M3 receptors, ma faʻaleleia aʻafiaga proangiogenic e ala i tulafono faatonutonu allosteric.
Primary ECs na vavae ese mai le aorta o isumu Suiselani. O le auala e faʻaaogaina na faʻafetaui mai le Kobayashi protocol 26 . Murine ECs na fa'atupuina i le EBM-2 fa'aopoopo fa'atasi ma le 5% FBS e le fa'aaogaina le vevela se'ia o'o i le vaega lona fa.
O le aʻafiaga o faʻasalalauga e lua o le DEET i luga o le faʻalauteleina o le HUVEC, U87MG, poʻo le BF16F10 na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). I se faapuupuuga, 5.103 sela i le vaieli sa fatu i totonu o se ipu 96-vaieli, faʻatagaina e faʻapipiʻi i le po, ona togafitia lea i le DEET mo le 24 itula. A uma ona aveese le ala o le tuputupu aʻe, faʻapipiʻi vaifofo fusifusia i vaieli taʻitasi o le microplate ma faʻanofo sela i le 37 °C mo le 30 min. Ole maualuga ole fluorescence na fuafuaina ile faʻaaogaina o le Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Siamani) faʻapipiʻiina i le 485 nm filiga faʻamalosi ma le 530 nm emission filters.
O le HUVEC na fa'asusuina i totonu o papatusi 96-vaieli i le mamafa e 104 sela i le vaieli. O sela na togafitia ile DEET mo le 24 itula. Na suʻesuʻeina le faʻaogaina o le cell e faʻaaoga ai se suʻega MTT colorimetric (Sigma-Aldrich, M5655). O le maualuga o le mata'utia na maua i luga o le multimode microplate reader (Mithras LB940) i le galu o le 570 nm.
O aʻafiaga o le DEET na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai suʻega in vitro angiogenesis. Togafitiga faʻatasi ma le 10-8 M poʻo le 10-5 M DEET na faʻateleina le faʻavaeina o le umi o capillary i HUVECs (Fig. 1a, b, paʻepaʻe paʻepaʻe). Pe a faʻatusatusa i le vaega faʻatonutonu, togafitiga faʻatasi ma DEET faʻatonuga mai le 10-14 i le 10-5 M na faʻaalia ai o le umi o le capillary na oʻo atu i le maualuga i le 10-8 M DEET (Faʻaopoopo Ata S2). E leai se eseesega tele na maua i le in vitro proangiogenic aafiaga o HUVECs togafitia ma DEET i le faʻaogaina o le 10-8 M ma le 10-5 M.
Ina ia iloa le aʻafiaga o le DEET i le neovascularization, matou te faia i vivo neovascularization suʻesuʻega. A maeʻa aso 14, o isumu na tui i sela endothelial na muaʻi faʻamaʻiina i le 10-8 M poʻo le 10-5 M DEET na faʻaalia ai se faʻaopoopoga tele o le hemoglobin (Fig. 1c, paʻepaʻe paʻepaʻe).
E le gata i lea, o le DEET-induced neovascularization na suʻesuʻeina i U87MG xenograft-bearing mice na tui i aso taʻitasi (ip) ma le DEET i se vailaʻau e iloa e faʻaosofia ai le plasma concentrations o le 10-5 M, lea e masani ai i tagata faʻaalia. i le 23. Tula e mafai ona iloa (ie tuma> 100 mm3) na matauina i le 14 aso talu ona tu'iina sela U87MG i isumu. I le aso 28, o le tuputupu aʻe o le tumo na matua faʻaleleia i isumu faʻataʻitaʻiina DEET pe a faʻatusatusa i isumu pulea (Fig. 1d, sikuea). E le gata i lea, o le pisipisia o le CD31 o tuma na faʻaalia ai o le DEET na matua faʻateleina le vaega o capillary ae le o le microvessel density. (Ata. 1e–g).
Ina ia fuafuaina le matafaioi a le muscarinic receptors i le DETA-induced proliferation, 10-8 M poʻo 10-5 M DETA i luma o le pFHHSiD (10-7 M, o se M3 receptor antagonist) na faʻaaogaina. Togafitiga ole HUVEC. pFHHSiD na poloka atoa le fa'ateleina o meatotino a le DETA i fa'atonuga uma (Laulau 1).
I lalo o nei tulaga, na matou suʻesuʻeina foi pe faʻateleina e le DEET le umi o capillary i sela HUVEC. E faapena foi, o le pFHHSiD na matua taofia le umi o capillary e mafua mai i le DEET (Fig. 1a, b, paʻu efuefu). E le gata i lea, o faʻataʻitaʻiga tutusa na faia i le M3 siRNA. E ui lava o le pulea o le siRNA e leʻi aoga i le faʻalauiloaina o le faʻavaeina o capillary, o le faʻaogaina o le M3 muscarinic receptor na faʻaumatia ai le malosi o le DEET e faʻateleina ai le umi o capillary (Fig 1a, b, paʻu uliuli).
E le gata i lea, o le 10-8 M poʻo le 10-5 M DEET-faʻapipiʻiina vascularization in vitro ma neovascularization in vivo na matua poloka e pFHHSiD (Fig. 1c, d, liʻo). O nei faʻaiʻuga e faʻaalia ai o le DEET e faʻamalosia le angiogenesis e ala i se auala e maʻaleʻale i le filifilia o le M3 antagonists poʻo le M3 siRNA.
AChE o le mole mole mole o le DEET. O vaila'au e pei o donepezil, lea e fai ma inhibitors AChE, e mafai ona fa'aosofia ai le EC angiogenesis in vitro ma i le isumu hindlimb ischemia models14. Na matou suʻesuʻeina le aʻafiaga o faʻatonuga e lua o le DEET i luga ole gaioiga ole enzyme AChE ile HUVEC. O le maualalo (10-8 M) ma le maualuga (10-5 M) faʻasalaga o le DEET na faʻaititia ai le endothelial AChE gaioiga faʻatusatusa i tulaga faʻatonutonu (Fig. 2).
O faʻasalalauga uma e lua o le DEET (10-8 M ma le 10-5 M) faʻaititia le acetylcholinesterase gaioiga i HUVEC. BW284c51 (10-5 M) na faʻaaogaina e avea o se faʻatonuga mo le acetylcholinesterase inhibitors. O fa'ai'uga o lo'o fa'aalia e pei o le pasene o gaioiga AChE i luga o le HUVEC o lo'o togafitia i le lua fa'atonuga o le DEET fa'atusatusa i sela e togafitia i ta'avale. O tau o loʻo faʻaalia o le uiga ± SEM o suʻega tutoatasi e ono. * p <0.05 faʻatusatusa i le pulea (Kruskal-Wallis ma Dunn suʻega faʻatusatusaga tele).
Nitric oxide (NO) o loʻo aʻafia i le angiogenic process 33, o le mea lea, E LEAI se gaosiga i DEET-stimulated HUVECs na suʻesuʻeina. Na faʻateleina le gaosiga ole endothelial NO ile DEET pe a faʻatusatusa i sela pulea, ae na oʻo i le taua ile fua ole 10-8 M (Fig 3c). Ina ia iloa suiga mole mole pulea DEET-faʻaosoina NO gaosiga, faʻamatalaga eNOS ma faʻagaioiga na suʻesuʻeina e Western blotting. E ui lava e leʻi suia e le togafitiga DEET le faʻaaliga o le eNOS, na matua faʻateleina le phosphorylation eNOS i lona nofoaga faʻagaoioia (Ser-1177) aʻo faʻaitiitia lona nofoaga faʻalavelave (Thr-495) faʻatusatusa i sela e leʻi togafitia i le eNOS phosphorylation (Fig 3d). E le gata i lea, o le fua faatatau o le phosphorylated eNOS i le nofoaga o le faʻagaoioia ma le nofoaga faʻalavelave na fuafuaina pe a uma ona faʻavasega le aofaʻi o le eNOS phosphorylated i le aofaʻi atoa o le enzyme. O lenei fua faatatau na matua faateleina i HUVEC na togafitia i faʻatonuga taʻitasi o le DEET faʻatusatusa i sela e leʻi togafitia (Fig 3d).
Mulimuli ane, o le faʻamatalaga o le VEGF, o se tasi o mea taua o le proangiogenic, na suʻesuʻeina e Western blotting. O le DEET na matua faʻateleina le faʻaaliga VEGF, ae o le pFHHSiD na poloka atoa lenei faʻamatalaga.
Talu ai o aʻafiaga o le DEET e maʻaleʻale i poloka faʻafomaʻi ma le faʻaititia o le M3 faʻafeiloaʻi, na matou faʻataʻitaʻiina le manatu e mafai e le DEET ona faʻaleleia le faʻailoga o le calcium. O le mea e ofo ai, na le mafai e le DEET ona faʻateleina le calcium cytoplasmic i HUVEC (faʻamatalaga e le o faʻaalia) ma HEK / M3 (Fig. 4a, b) mo faʻaoga uma e lua na faʻaaogaina.
Taimi meli: Tes-30-2024