O le tuputupu aʻe o le meristem apical (SAM) e taua tele mo le fausaga o laʻau. Hormone totogiberellins(GAs) e fai sao taua i le faamaopoopoina o le tuputupu a'e o laau, ae o lo latou sao i le SAM e tumau pea ona le malamalama. O iinei, na matou atia'e ai se fuafa'atatau biosensor o le faailoilo GA e ala i le inisinia le porotini DELLA e taofia ai lana galuega fa'atonutonu taua i le tali fa'aliliuga GA a'o fa'asaoina lona fa'aleagaina i luga o le aloa'ia GA. Matou te faʻaalia o lenei biosensor faʻavae faʻaleagaina o loʻo faʻamaumau saʻo suiga i tulaga GA ma lagona feaveaʻi i le taimi o atinaʻe. Na matou fa'aogaina lenei biosensor e fa'afanua GA fa'ailoga gaioiga i le SAM. Matou te faʻaalia o faʻailoga maualuga GA o loʻo i ai i totonu o sela o loʻo i le va o le okeni primordia, o mea ia e muamua i totonu o sela. I le faʻaaogaina o auala e maua ai ma leiloa-o-galuega, matou te faʻaalia atili ai o le GA e faʻatonutonuina le faʻatonuga o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa, faʻavaeina le faʻaogaina o le telefoni feaveaʻi o internodes, ma faʻamalosia ai le faʻamatalaga o le internode i le SAM.
O le fana apical meristem (SAM), o loʻo i le pito i luga o le fana, o loʻo i ai se faʻailoga o sela o loʻo faʻatupuina ai totoga pito i tua ma nodes i se faiga faʻapitoa ma faʻasolosolo i le olaga atoa o le laau. O vaega ta'itasi ta'itasi, po'o nodes o la'au, e aofia ai i totonu ma totoga pito i tua i pona, ma meristem axillary i axils lau1. O le tuputupu aʻe ma le faʻatulagaina o nodes laau e suia i le taimi o le atinaʻe. I Arabidopsis, o le tuputupu aʻe o le internodal e taofiofia i le taimi o le vegetative stage, ma o axillary meristems e tumau pea le moe i axils o lau rosette. I le taimi o le suiga i le vaega fuga, o le SAM e avea ma inflorescence meristem, fa'atupuina fa'ava'a fa'ava'a ma fuga axillary, lala lala i axils o lau cauline, ma mulimuli ane, fuga e leai ni lau2. E ui lava ua tatou alualu i luma taua i le malamalama i auala e pulea ai le amataina o lau, fugalaau, ma lala, e itiiti lava se mea e iloa e uiga i le auala e tulaʻi mai ai totonu.
O le malamalama i le tufatufaina atu o le spatiotemporal GA o le a fesoasoani e malamalama atili ai i galuega a nei hormones i masini eseese ma i tulaga eseese o atinaʻe. O le vaʻaia o le faʻaleagaina o le RGA-GFP fusion faʻaalia i lalo o le gaioiga a lana lava faʻasalalauga e maua ai faʻamatalaga taua i le faʻatonutonuina o le aofaʻi o GA i aʻa15,16. Ae ui i lea, o le RGA faʻaaliga e fesuisuiaʻi i luga o masini17 ma faʻatonutonuina e GA18. O le mea lea, o faʻamatalaga eseese o le faʻalauiloaina o le RGA e mafai ona iʻu ai i le faʻasologa o le fluorescence o loʻo matauina i le RGA-GFP ma o lenei metotia e le faʻatusatusa. Talu ai nei lava, o le bioactive fluorescein (Fl) -labeled GA19,20 na faʻaalia ai le faʻaputuina o GA i le aʻa endocortex ma le faʻatonutonuina o ona tulaga feaveaʻi e GA felauaiga. Talu ai nei, o le GA FRET sensor nlsGPS1 na faʻaalia ai o GA maualuga e fesoʻotaʻi ma le faʻalauteleina o sela i aʻa, filaments, ma hypocotyls21. Ae ui i lea, e pei ona tatou vaʻaia, e le naʻo le faʻatonuga o le GA e pulea ai le gaioiga o le faʻailoga GA, aua e faʻalagolago i faiga faʻalogona lavelave. O iinei, faʻavae i luga o lo matou malamalama i auala faʻailoga DELLA ma GA, matou te lipotia le atinaʻeina ma faʻamatalaga o se biosensor ratiometric faʻavae faʻaleagaina mo le faʻailoga GA. Ina ia atiaʻe lenei biosensor quantitative, matou te faʻaogaina se mutant GA-sensitive RGA lea na faʻapipiʻiina i se polotini fluorescent ma faʻaalia i soo se mea i totonu o masini, faʻapea foʻi ma se GA-e le maʻaleʻale porotini fluorescent. Matou te faʻaalia o le mutant RGA protein fusions e le faʻalavelave i le gaʻo gaʻo gaʻo pe a faʻaalia i soo se mea, ma e mafai e lenei biosensor ona faʻatusatusa le gaioiga faʻailo e mafua mai i le GA faʻaogaina ma le faʻaogaina o faailoilo GA e le masini faʻalogo ma le maualuga spatiotemporal iugafono. Na matou faʻaogaina lenei biosensor e faʻafanua le tufatufaina atu o le GA faʻailoga gaioiga ma faʻatusatusa pe faʻafefea ona faʻatonutonuina e GA le amio feaveaʻi i le SAM epidermis. Matou te faʻaalia o le GA e faʻatonutonuina le faʻatulagaina o le vaeluaga o le vaeluaga o sela SAM o loʻo i le va o le okeni primordia, ma faʻamalamalamaina ai le faʻalapotopotoga telefoni feaveaʻi o le internode.
Mulimuli ane, na matou fesili pe mafai e le qmRGA ona lipotia suiga i laʻasaga GA faʻaogaina e faʻaaoga ai hypocotyls tuputupu aʻe. Na matou faʻaalia muamua o le nitrate e faʻaosofia ai le tuputupu aʻe e ala i le faʻateleina o le GA faʻatasi ma, i le isi itu, DELLA34 faʻaleagaina. E tusa ai ma lea, na matou matauina o le umi o le hypocotyl i le pUBQ10 :: qmRGA laau toto na ola i lalo o le tele o le sapalai o le nitrate (10 mM NO3−) e sili atu le umi nai lo le laau na ola i lalo o tulaga e le lava le nitrate (Faaopoopo Ata 6a). E ogatasi ma le tali atu i le tuputupu aʻe, o faʻailoga GA na sili atu i le hypocotyls o fatu laau na ola i lalo o le 10 mM NO3− tulaga nai lo le totoina o fatu i le leai o ni nitrate (Faʻaopoopo Ata 6b, c). O le mea lea, o le qmRGA e mafai ai foʻi ona mataʻituina suiga i le faʻailoga GA faʻaosoina e suiga i totonu ole GA faʻatonuga.
Ina ia malamalama pe o le GA faʻailoga gaioiga e iloa e le qmRGA e faʻalagolago i le GA faʻatonuga ma le GA faʻaaliga, e pei ona faʻamoemoeina e faʻavae i luga o le mamanu masini, matou te suʻesuʻeina le faʻaaliga o le tolu GID1 faʻafeiloaʻi i vegetative ma fatuga. I fatu, o le GID1-GUS tusitala laina na faʻaalia ai le GID1a ma le c na faʻaalia maualuga i cotyledons (Fig. 3a-c). E le gata i lea, o mea uma e tolu na faʻaalia i laulaau, lateral root primordia, root tips (sei vagana ai le pulou aʻa o le GID1b), ma le vascular system (Fig. 3a-c). I le inflorescence SAM, na matou mauaina faʻailoga GUS mo naʻo GID1b ma 1c (Faʻaopoopo Ata 7a-c). In situ hybridization na faʻamaonia ai nei faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga ma faʻaalia atili ai o le GID1c na faʻaalia tutusa i tulaga maualalo i le SAM, ae o le GID1b na faʻaalia le maualuga o faʻamatalaga i le pito o le SAM (Faʻaopoopo Ata 7d-l). O le pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b faʻaliliuga faʻaliliuga na faʻaalia ai foi le faʻavasegaina o le GID1b faʻaaliga, mai le maualalo pe leai se faʻaaliga i le ogatotonu o le SAM i le maualuga o le faʻaaliga i le okeni tuaoi (Faʻaopoopo Ata 7m). O le mea lea, GID1 faʻafeiloaʻi e leʻo tufatufaina tutusa i totonu ma totonu o masini. I faʻataʻitaʻiga mulimuli ane, na matou matauina foi o le faʻaalia o le GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) na faʻateleina ai le lagona o le qmRGA i hypocotyls i fafo GA talosaga (Fig. 3d, e). I se faʻatusatusaga, o le fluorescence na fuaina e le qd17mRGA i le hypocotyl e leʻi faʻaogaina i togafitiga GA3 (Fig. 3f, g). Mo faʻataʻitaʻiga uma e lua, o fualaʻau na togafitia i le maualuga o le GA (100 μM GA3) e iloilo ai le vave o amioga a le masini, lea na faʻaleleia pe leiloa ai le gafatia e fusifusia ai le GID1. Faʻatasi, o nei faʻaiʻuga e faʻamaonia ai o le qmRGA biosensor o loʻo faʻaaogaina se galuega tuʻufaʻatasia e pei o se GA ma GA sensor, ma fautua mai o faʻamatalaga eseese o le GID1 faʻafeiloaʻi e mafai ona faʻaogaina tele le emissivity o le masini.
E oʻo mai i le taimi nei, o le tufatufaina atu o faailoilo GA i le SAM o loʻo tumau pea le le manino. O le mea lea, na matou faʻaogaina ai le qmRGA-expressing plants ma le pCLV3:: mCherry-NLS stem cell reporter35 e faʻatatau i faʻafanua faʻatulagaina maualuga o GA faʻailoga gaioiga, e taulaʻi i luga o le L1 layer (epidermis; Fig. 4a, b, vaʻai Metotia ma Metotia Faaopoopo), talu ai o le L1 o loʻo i ai se sao taua i le puleaina o le tuputupu aʻe o le SAM36. O iinei, pCLV3::mCherry-NLS fa'amatalaga na tu'uina atu ai se fa'asinomaga fa'asinomaga fa'amautu mo le su'esu'eina o le fa'asoa fa'asinoala ole GA fa'ailoga gaioiga37. E ui lava o GA e manatu e taua mo le atinaʻeina o totoga pito i tua4, na matou matauina o faailo GA na maualalo i le fugalaʻau fugalaʻau (P) amata mai le P3 stage (Fig. 4a, b), ae o le P1 ma le P2 primordiums talavou sa i ai le gaioiga faʻapitoa e tutusa ma le ogatotonu (Fig. 4a, b). O le maualuga o le gaioiga o le faailoilo GA na maua i le okeni primordium tuaoi, e amata i le P1 / P2 (i itu o le tuaoi) ma le tumutumu i le P4, faʻapea foʻi ma sela uma o le vaega pito i luga o loʻo i le va o le primordia (Fig. 4a, b ma le Fig 8a, b). O lenei gaioiga maualuga GA faʻamaonia sa matauina e le gata i le epidermis ae faʻapea foʻi ile L2 ma luga ole L3 layers (Faʻaopoopo Ata 8b). O le mamanu o faʻailoga GA na maua i le SAM e faʻaaoga ai le qmRGA na tumau pea le le suia i le taimi (Faʻaopoopo Ata 8c-f, k). E ui lava o le fausiaina o le qd17mRGA na faʻapipiʻiina i lalo i le SAM o T3 laau mai laina tutoʻatasi e lima na matou faʻamatalaina auiliili, na mafai ona matou faʻavasegaina faʻasologa o le fluorescence na maua i le pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP construct (Faʻaopoopo Ata 8g-j, l). I totonu o lenei laina faʻatonutonu, naʻo ni suiga laiti i le fluorescence ratio na maua i le SAM, ae i totonu o le SAM centre na matou matauina ai se faʻaitiitia manino ma le faʻafuaseʻi i VENUS e fesoʻotaʻi ma TagBFP. O lenei mea e faʻamaonia ai o le faʻailoga faʻailoga na matauina e qmRGA o loʻo atagia mai ai le faʻaleagaina o le GA-faʻalagolago i le mRGA-VENUS, ae faʻaalia ai foi e mafai e le qmRGA ona faʻateleina le gaioiga faʻailoga GA i le nofoaga autu o le meristem. I le aotelega, o matou faʻaiʻuga e faʻaalia ai se mamanu faʻailoga GA e faʻaalia ai le tufatufaina o le primordia. O lenei tufatufaga o le itulagi inter-primordial (IPR) e mafua ona o le faasolosolo malie o le faʻavaeina o le maualuga o le gaioiga o le GA i le va o le atinaʻeina o le primordium ma le ogatotonu, ae i le taimi lava e tasi e faʻaitiitia ai le gaioiga o le GA i le primordium (Fig 4c, d).
O le tufatufaina atu o GID1b ma GID1c faʻafeiloaʻi (silasila i luga) o loʻo fautua mai ai o faʻamatalaga eseese o tali GA e fesoasoani i le faʻatulagaina o le mamanu o gaioiga faʻailoga GA i le SAM. Na matou mafaufau pe mafai ona aʻafia le faʻaputuga eseese o GA. Ina ia suʻesuʻeina lenei avanoa, na matou faʻaogaina le nlsGPS1 GA FRET sensor21. Faʻateleina le faʻagaoioia o taimi na maua i le SAM o le nlsGPS1 na togafitia i le 10 μM GA4 + 7 mo le 100 min (Faʻaopoopo Fig. 9a-e), e faʻaalia ai e tali atu le nlsGPS1 i suiga i le GA faʻatonuga i le SAM, e pei ona faia i roots21. Fa'asoa fa'afanua o le nlsGPS1 fa'agaoioia taimi na fa'aalia ai le maualalo o le maualuga o le GA i le pito i fafo o le SAM, ae na fa'aalia ai na maualuga i le ogatotonu ma i tua'oi o le SAM (Fig. 4e ma le Fa'aopoopo Ata 9a, c). O loʻo faʻaalia ai o GA o loʻo tufatufa atu i le SAM faʻatasi ai ma se mamanu faʻafanua faʻatusatusa i le faʻaalia e qmRGA. I le avea ai o se auala faʻafesoʻotaʻi, na matou togafitia foi le SAM i le GA3-, GA4-, GA7-Fl) poʻo le Fl naʻo ia o se pule le lelei. O le faailo Fl na tufatufa atu i le SAM atoa, e aofia ai le ogatotonu tutotonu ma le primordium, e ui lava i le maualalo o le malosi (Fig. 4j ma le Faʻaopoopoga Ata 10d). I se faʻatusatusaga, o GA-Fl uma e tolu na faʻaputuina faʻapitoa i totonu o tuaoi muamua ma i tikeri eseese i le vaega o totoe o le IPR, faʻatasi ai ma GA7-Fl faʻaputuina i le pito sili ona tele i totonu o le IPR (Fig. 4k ma le Faʻaopoopo Fig. 10a,b). O le faʻatusatusaina o le malosi o le fluorescence na faʻaalia ai le maualuga o le IPR i le non-IPR i le GA-Fl-treated SAM pe a faʻatusatusa i le Fl-treated SAM (Fig. 4l ma le Faʻaopoopoga Ata 10c). Faʻatasi, o nei faʻaiʻuga e taʻu mai ai o le GA o loʻo i ai i tulaga maualuga i totonu o sela IPR o loʻo tu latalata i le tuaoi o okeni. O loʻo faʻaalia ai o le faʻataʻitaʻiga o le SAM GA faʻailoga gaioiga e maua mai i faʻamatalaga eseese uma o tali GA ma faʻaputuga eseese o GA i sela IPR latalata i tuaoi okeni. O le mea lea, o la matou auʻiliʻiliga na faʻaalia ai se faʻataʻitaʻiga faʻafuaseʻi spatiotemporal o le faailoilo GA, faʻatasi ai ma le maualalo o le gaioiga i le ogatotonu ma le primordium o le SAM ma le maualuga o le gaioiga i le IPR i le pito i tua.
Ina ia malamalama i le matafaioi o le eseesega GA faʻailoga gaioiga i le SAM, na matou suʻesuʻeina le faʻamaopoopoina i le va o le gaioiga faʻamaonia GA, faʻalauteleina o le cell, ma le vaeluaga o le cell e faʻaaoga ai le taimi-taimi faʻataʻitaʻiga o le SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Ona o le matafaioi a le GA i le tuputupu aʻe o tulafono faatonutonu, o se faʻamaopoopo lelei ma faʻasologa o le faʻalauteleina o sela na faʻamoemoeina. O le mea lea, na matou faʻatusatusa muamua faʻafanua gaioiga faʻamaonia GA ma faʻafanua o le fua o le tuputupu aʻe o le cell (e fai ma sui mo le malosi o le faʻalauteleina o le cell mo se cell tuʻuina atu ma mo teineiti sela i le vaevaega) ma faʻafanua o le tuputupu aʻe anisotropy, lea e fua ai le directionality o le faʻalauteleina o sela (faʻaaoga foi iinei mo se cell tuʻuina atu ma mo teine sela i vaevaega; Ata 5a,b, tagai Metotia ma Metotia Faaopoopo). O a matou faʻafanua o le SAM cell surface growth rate e ogatasi ma faʻamatalaga muamua38,39, faʻatasi ai ma le laʻititi o le tuputupu aʻe i le tuaoi ma le maualuga o le tuputupu ae o fugalaau (Fig. 5a). O su'esu'ega a le vaega autu (PCA) na fa'aalia ai o le gaioiina o le fa'ailoga GA e le lelei le feso'ota'iga ma le malosi o le tuputupu a'e o le sela (Ata 5c). Na matou faʻaalia foi o axes autu o fesuiaiga, e aofia ai le faʻailoga GA faʻailoga ma le malosi o le tuputupu aʻe, na faʻasolosolo i le itu na faʻamoemoeina e le maualuga o le CLV3 faʻamatalaga, faʻamaonia le le aofia ai o sela mai le nofoaga tutotonu o le SAM i suʻesuʻega o totoe. Spearman correlation analysis na faʻamaonia ai le PCA (Ata 5d), o loʻo faʻaalia ai o le maualuga o le GA faailoilo i le IPR e leʻi maua ai le faʻalauteleina o le telefoni. Ae ui i lea, o suʻesuʻega faʻamaopoopo na faʻaalia ai se faʻamaopoopo lelei i le va o le gaioiga o le faʻailoga GA ma le tuputupu aʻe anisotropy (Ata 5c, d), o loʻo fautua mai ai o le maualuga o le faʻailoga GA i le IPR e aʻafia ai le itu o le tuputupu aʻe o le cell ma atonu o le tulaga o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa.
a, b Faafanua vevela o le maualuga o le tuputupu aʻe o luga (a) ma le tuputupu aʻe anisotropy (b) i le SAM averesi i luga o laau tutoʻatasi fitu (faʻaaogaina e fai ma sui mo le malosi ma le itu o le faʻalauteleina o sela, faʻasologa). c su'esu'ega a le PCA na aofia ai suiga nei: GA fa'ailo, fa'atuputeleina o le fa'atuputeleina o le fa'atuputeleina o le fa'atuputeleina o le maualuga, anisotropy tuputupu a'e i luga, ma le fa'aaliga CLV3. O le vaega 1 o le PCA na tele lava ina le lelei le feso'ota'iga ma le malosi o le tuputupu a'e o luga ma fa'amaopoopo lelei ma fa'ailoga GA. O le PCA vaega 2 na faʻapipiʻiina lelei ma le tuputupu aʻe o le anisotropy ma le lelei faʻatasi ma le CLV3 faʻamatalaga. O pasene o lo'o fa'atusalia ai le fesuiaiga o lo'o fa'amatalaina e vaega ta'itasi. d Spearman su'esu'ega fa'atasi i le va o le fa'ailoga GA, fa'ateleina le fa'atupulaia o luga, ma le anisotropy tuputupu a'e i luga i le fua o le tino e le aofia ai le CZ. Ole numera ile itu taumatau ole tau ole Spearman rho ile va o fesuiaiga e lua. Asterisk o lo'o fa'ailoa mai ai mataupu e matua taua tele ai le fa'amaopoopo/le lelei fa'atasi. u Va'aiga 3D o sela Col-0 SAM L1 e ala ile microscopy confocal. O pa puipui fou na fausia i le SAM (ae le o le primordium) ile 10 h e lanu e tusa ai ma o latou tulaga taua. O le pa lanu o loʻo faʻaalia i le pito i lalo taumatau. O lo'o fa'aalia e le fa'aofi le ata fa'atusa 3D ile 0 h. Sa toe fai faalua le fa'ata'ita'iga fa'atasi ai ma taunu'uga tutusa. f Fa'ailoga pusa o lo'o fa'aalia ai fua faatatau o le vaevaega o sela i IPR ma le IPR Col-0 SAM (n = 10 laau tuto'atasi). O le laina ogatotonu o loʻo faʻaalia ai le vaeluagalemu, ma o tuaoi pusa o loʻo faʻaalia ai le 25 ma le 75 pasene. E fa'ailoa mai e le musumusu le tau maualalo ma le maualuga e fa'atatau i le polokalama R. P tau na maua i le su'ega t-tailed lua a Welch. g, h Ata fa'ata'ita'i o lo'o fa'aalia ai (g) pe fa'afefea ona fuaina le maualuga o le puipui fou (magenta) e fa'atatau i le fa'atonuga o le radial mai le ogatotonu o le SAM (laina togitogi paepae) (na'o le taua o le tulimanu mata'utia, ie, 0-90 °, e manatu), ma (h) le fa'asologa o le circumferential/lateral ma radial i totonu o le meristem. i Fa'asologa o fa'asologa o le va'aiga va'aiga o le va'aiga i luga o le SAM (lanu moana uliuli), IPR (lanumoana lanu moana), ma le le IPR (lanu moana malamalama). O tau P na maua e se suʻega lua-tailed Kolmogorov-Smirnov. Sa toe fai faalua le fa'ata'ita'iga fa'atasi ai ma taunu'uga tutusa. j Fa'asologa o fa'asologa o le va'aiga va'aiga o le va'aiga o le IPR i le P3 (lanumeamata malamalama), P4 (lanumeamata lanumeamata), ma le P5 (lanumeamata lanumeamata). O tau P na maua e se suʻega lua-tailed Kolmogorov-Smirnov. Sa toe fai faalua le fa'ata'ita'iga fa'atasi ai ma taunu'uga tutusa.
O le mea lea, na matou suʻesuʻeina ai le fesoʻotaʻiga i le va o le faʻailoga GA ma le gaioiga vaevaega e ala i le faʻailoaina o puipui fou na fausia i le taimi o le suʻega (Fig. 5e). O lenei faiga na mafai ai ona matou fuaina le taimi ma le itu o le vaevaega o sela. O le mea e ofo ai, na matou iloa ai o le tele o taimi o vaeluaga o sela i totonu o le IPR ma le isi vaega o le SAM (e le o le IPR, Fig. 5f) e tutusa, e faʻaalia ai o le eseesega i le GA faʻailoga i le va o le IPR ma le leai o le IPR e le afaina tele ai le vaevaega. O lenei, ma le faʻamaopoopo lelei i le va o le faʻailoga GA ma le tuputupu aʻe anisotropy, na faʻaosofia ai i matou e mafaufau pe mafai e le gaioiga faʻailoga GA ona aʻafia ai le faʻatulagaina o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa. Na matou fuaina le faʻatonuga o le puipui fou o le cell e pei o se tulimanu mataʻutia e fesoʻotaʻi ma le axis radial e fesoʻotaʻi ai le ogatotonu o le meristem ma le totonugalemu o le puipui fou (Fig. 5e-i) ma matauina se uiga manino mo sela e vaeluaina i tulimanu latalata i le 90 ° e faʻatatau i le axis radial, faʻatasi ai ma le maualuga maualuga o loʻo matauina i le 703-800 ° ma le 70-80%. (22.62%) (Fig. 5e, i), e fetaui ma vaevaega o sela i le faʻataʻitaʻiga / feʻaveaʻi (Ata 5h). Ina ia suʻesuʻeina le sao o le GA faʻailoga i lenei amio vaevaega, matou te suʻesuʻeina faʻasologa o le vaevaega o le cell i le IPR ma le le IPR eseese (Fig. 5i). Na matou matauina o le vaevaeina o le vaeluaga i totonu o sela IPR e ese mai i totonu o sela e le-IPR poʻo totonu o sela i totonu o le SAM atoa, faʻatasi ai ma sela IPR o loʻo faʻaalia ai se maualuga maualuga o vaeluaga o le lateral / circular cell divisions, ie, 70-80 ° ma 80-90 ° (33.86% ma 30.71%, faʻasologa, faʻatusatusaga 5). O le mea lea, o a matou faʻamatalaga na faʻaalia ai se fesoʻotaʻiga i le va o le maualuga o le faailoilo GA ma le vaʻavaʻa vaʻavaʻa vaʻavaʻavaʻa latalata i le itu faʻataʻamilomilo, e tutusa ma le faʻamaopoopoina i le va o le gaioiga faʻamaonia GA ma le tuputupu aʻe anisotropy (Fig. 5c, d). Ina ia faʻamautu atili le faʻasao faʻasao o lenei mafutaga, na matou fuaina le vaʻaiga vaʻavaʻa i totonu o sela IPR o loʻo siomia ai le primordium e amata mai i le P3, talu ai na maua le maualuga o le gaioiga o le faailoilo GA i lenei itulagi e amata mai i le P4 (Fig 4). Ole vaeluaga ole vaega ole IPR ile P3 ma le P4 e leʻi faʻaalia ai se eseesega taua tele, e ui lava o le faʻateleina o taimi ole vaeluaga o le lateral cell na matauina ile IPR ile P4 (Fig. 5j). Ae ui i lea, i totonu o sela IPR i le P5, o le eseesega i le faʻatulagaina o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa na avea ma fuainumera taua, faʻatasi ai ma le faʻateleina o le faʻateleina o le fevaevaeaʻiga faʻasolosolo (Fig. 5j). Faʻatasi, o nei faʻaiʻuga o loʻo fautua mai ai e mafai e le faʻailoga GA ona pulea le faʻaogaina o vaega o le cell i le SAM, lea e ogatasi ma lipoti talu ai40,41 e mafai e le faʻailoga maualuga o le GA ona faʻaosofia le faʻaogaina o le vaeluaga o le IPR.
O loʻo valoia o sela i totonu o le IPR o le a le tuʻufaʻatasia i totonu o le primordia ae i totonu o internodes2,42,43. O le fa'asologa fa'asolosolo o vaevaega o sela i totonu o le IPR e mafai ona i'u ai i le fa'atulagaina masani o laina fa'ava'ai tutusa o sela epidermal i totonu o totonu. O a matou faʻamatalaga o loʻo faʻamatalaina i luga o loʻo fautua mai ai o le faʻailoga GA e ono faia se sao i lenei faagasologa e ala i le faʻatonutonuina o le itu o le vaeluaga o sela.
O le leiloa o galuega a le tele o genes DELLA e maua ai se tali GA fa'avae, ma e mafai ona fa'aoga della mutants e su'e ai lenei manatu44. Na matou suʻesuʻeina muamua faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga o genes DELLA e lima i le SAM. Faʻasologa faʻasologa o le GUS line45 na faʻaalia ai o le GAI, RGA, RGL1, ma le RGL2 (i se tulaga maualalo) na faʻaalia i le SAM (Faʻaopoopo Ata 11a-d). In situ hybridization na faʻaalia atili ai o le GAI mRNA e faʻaputuina faʻapitoa i le primordia ma le atinaʻeina o fugalaau (Faʻaopoopo Ata 11e). O le RGL1 ma le RGL3 mRNA na maua i totonu o le SAM canopy ma fugalaau matutua, ae o le RGL2 mRNA na sili atu ona tele i le itulagi tuaoi (Faaopoopo Ata 11f-h). Confocal imaging o pRGL3 :: RGL3-GFP SAM faʻamaonia le faʻamatalaga na matauina e in situ hybridization ma faʻaalia ai o le RGL3 protein e faʻaputuina i le ogatotonu o le SAM (Faʻaopoopo Ata 11i). I le faʻaaogaina o le laina pRGA :: GFP-RGA, na matou iloa ai foi o le RGA protein e faʻaputuina i le SAM, ae o lona tele e faʻaitiitia i le tuaoi e amata mai i le P4 (Faʻaopoopo Ata 11j). O le mea moni, o faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga o le RGL3 ma le RGA o loʻo ogatasi ma le maualuga o le GA faʻailoga gaioiga i le IPR, e pei ona iloa e qmRGA (Fig. 4). E le gata i lea, o nei faʻamatalaga o loʻo faʻaalia ai o DELLA uma o loʻo faʻaalia i le SAM ma o latou faʻamatalaga faʻatasi e vaʻaia le SAM atoa.
Na matou suʻesuʻeina le faʻasologa o le vaevaega o sela i le SAM (Ler, control) ma le gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Fig. 6a, b). O le mea e malie ai, na matou matauina se suiga taua tele i le tufatufaina atu o laina laina o le vaevaega o sela i le della global mutant SAM pe a faatusatusa i le ituaiga vao (Fig. 6c). O lenei suiga i le della global mutant na mafua ona o le faateleina o le tele o le 80-90 ° angles (34.71% vs. 24.55%) ma, i se tulaga maualalo, 70-80 ° angles (23.78% vs. 20.18%), o lona uiga, e fetaui ma fevaevaeaʻiga faʻasolosolo (Fig 6c). O le tele o vaevaega e le faʻafefeteina (0-60 °) na maualalo foi i le della global mutant (Fig. 6c). O le tele o vaevaega faʻasolosolo faʻasolosolo na matua faateleina i le SAM o le della global mutant (Fig 6b). O le tele o vaevaega faʻasolosolo i totonu o le IPR na maualuga atu foi i le della global mutant pe a faʻatusatusa i le ituaiga vao (Fig. 6d). I fafo atu o le itulagi IPR, o le ituaiga vao e sili atu le tufatufaina tutusa o tulimanu vaevaega o sela, ae o le della global mutant e fiafia i vaega vavalalata e pei o le IPR (Fig. 6e). Na matou fuaina foʻi le faʻatulagaina o vaevaega o sela i le SAM o ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ma ga2ox6-2), o se GA-inactive mutant background lea e faʻaputu ai GA. E tusa ai ma le faateleina o le maualuga o le GA, o le SAM o le quintuple ga2ox mutant inflorescence na sili atu nai lo le Col-0 (Supplementary Fig. 12a, b), ma faʻatusatusa i Col-0, o le quintuple ga2ox SAM na faʻaalia ai se tufatufaina manino ese o tulimanu vaevaega o sela, faʻatasi ai ma le faʻateleina o le faʻasolosolo mai le 50 ° i le 900. 12a–c). O le mea lea, matou te faʻaalia ai o le faʻamalosia o le GA faʻailoga ma le faʻaputuga GA e faʻaosoina ai le vaeluaga o sela i le IPR ma le isi vaega o le SAM.
a, b 3D faʻaaliga o le L1 layer o le PI-stained Ler (a) ma le global della mutant (b) SAM faʻaaogaina microscopy confocal. O pa puipui fou na fausia i le SAM (ae le o le primordium) i luga o le 10-h vaitaimi o loʻo faʻaalia ma valivali e tusa ai ma o latou tulaga taua. O lo'o fa'aalia le SAM ile 0 h. O lo'o fa'aalia le pa lanu i le pito i lalo taumatau. O le aū i le (b) o loʻo faʻasino i se faʻataʻitaʻiga o faila faila i le lalolagi della mutant. Sa toe fai faalua le fa'ata'ita'iga fa'atasi ai ma taunu'uga tutusa. fa'atusatusaga o le fa'asologa o le tufatufaina atu o va'aiga va'alele va'ava'a i le SAM atoa (d), IPR (e), ma le le IPR (f) i le va o Ler ma le lalolagi atoa. P tau na maua e faʻaaoga ai le suʻega Kolmogorov-Smirnov e lua-tail. f, g Fa'aaliga 3D o ata fa'afememea'i o SAM pisipisia PI o Col-0 (i) ma pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) la'au transgenic. Panels (a, b) faʻaalia puipui fou (ae le o le primordia) na fausia i le SAM i totonu ole 10 h. Sa toe fai faalua le fa'ata'ita'iga fa'atasi ai ma taunu'uga tutusa. h–j Fa'atusatusaga o le fa'asoa fa'atelega o va'aiga va'ava'a va'ava'aiga o lo'o i totonu o le SAM atoa (h), IPR (i) ma le le-IPR (j) i le va o le Col-0 ma le pCUC2 :: gai-1-VENUS la'au. P tau na maua e faʻaaoga ai se suʻega lua-tailed Kolmogorov-Smirnov.
Na matou toe faʻataʻitaʻia le aʻafiaga o le taofia o le faʻailoga GA faʻapitoa i le IPR. I lea tulaga, matou te faʻaaogaina le cotyledon cup 2 (CUC2) faʻalauiloaina e faʻaosoina ai le faʻaalia o se gai-1 le lelei gai-1 polotini faʻafefiloi i VENUS (i le pCUC2 :: gai-1-VENUS laina). I le vao-ituaiga SAM, o le CUC2 faʻalauiloa faʻauluina le faʻaaliga o le tele o IPRs i le SAM, e aofia ai sela tuaoi, mai le P4 agai i luga, ma faʻamatalaga patino tutusa na matauina i pCUC2 :: gai-1-VENUS laau (silasila i lalo). O le tufatufaina atu o tulimanu o le vaevaega o sela i luga o le SAM poʻo le IPR o pCUC2 :: gai-1-VENUS laau e leʻi matua ese lava mai le ituaiga vao, e ui lava na faʻafuaseʻi ona matou maua o sela e aunoa ma se IPR i totonu o nei laau e vaevaeina i se maualuga maualuga o le 80-90 ° (Fig 6f-j).
Ua fautuaina e faapea o le itu o le vaevaega o sela e faalagolago i le geometry o le SAM, ae maise lava le mamafa o le tensile e mafua mai i le curvature46. O lea na matou fesili ai pe na suia foliga o le SAM i le della global mutant ma pCUC2:: gai-1-VENUS laau. E pei ona lipotia muamua12, o le tele o le della global mutant SAM e sili atu nai lo le ituaiga vao (Faaopoopo Ata 13a, b, d). In situ hybridization o le CLV3 ma le STM RNA faʻamaonia le faʻalauteleina o le meristem i della mutants ma faʻaalia atili ai le faʻalauteleina o le pito i tua o le faʻaogaina o le sela (Faʻaopoopo Ata 13e, f, h, i). Ae ui i lea, o le SAM curvature e tutusa i genotypes e lua (Faʻaopoopo Ata 13k, m, n, p). Na matou matauina se faʻaopoopoga tutusa i le gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant e aunoa ma se suiga i le curvature pe a faʻatusatusa i le ituaiga vao (Faʻaopoopo Ata 13c, d, g, j, l, o, p). O le tele o taimi o le vaevaega o le cell na aʻafia foi i le della quadruple mutant, ae i se tulaga maualalo nai lo le della monolithic mutant (Faaopoopo Ata 12d-f). O lenei aʻafiaga, faʻatasi ai ma le leai o se aʻafiaga i luga o le curvature, o loʻo fautua mai ai o le vaega totoe o le RGL3 i le Della quadruple mutant e faʻatapulaʻaina suiga i le vaeluaga o le cell orientation e mafua mai i le leiloa o le gaioiga DELLA ma o suiga i vaega pito i tua e tupu i le tali atu i suiga i GA faʻailoga gaioiga nai lo suiga ile SAM geometry. E pei ona faʻamatalaina i luga, o le CUC2 faʻalauiloaina le faʻaalia o le IPR i le SAM e amata i le P4 (Faʻaopoopo Ata 14a, b), ma i se faʻatusatusaga, o le pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM sa faʻaititia le tele ae maualuga le curvature (Faʻaopoopo Ata 14c-h). O lenei suiga ile pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology e mafai ona iu ai i se tufatufa eseʻesega o faʻalavelave faʻainisinia pe a faʻatusatusa i le ituaiga vao, lea e amata ai le mamafa o le circumferential i se mamao puupuu mai le SAM center47. I le isi itu, o suiga i le pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology e mafai ona mafua mai i suiga i mea faʻainisinia faʻaitulagi faʻaosoina e le transgene expression48. I tulaga uma e lua, o lenei mea e mafai ona faʻafefeina ai aʻafiaga o suiga i le GA faʻailoga e ala i le faʻateleina o le avanoa e vaeluaina ai sela i le faʻasologa o le circumferential / transverse, faʻamatalaina a tatou matauga.
Ile tu'ufa'atasia, o matou fa'amaumauga e fa'amaonia ai o le maualuga o le fa'ailoga GA o lo'o i ai se sao malosi i le fa'ata'ita'iga pito i tua o le va'alele vaeluaga i le IPR. Latou te faʻaalia foi o le curvature meristem e aʻafia ai foi le faʻatulagaina o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa i le IPR.
O le faʻasologa faʻasolosolo o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa i totonu o le IPR, ona o le maualuga o le gaioiina o le GA, o loʻo fautua mai ai e faʻapipiʻi muamua e GA se faila faila radial i le epidermis i totonu o le SAM e faʻamalamalama ai le faʻalapotopotoga faʻapitoa lea o le a maua mulimuli ane i le epidermal internode. O le mea moni, o ia faila faila e masani ona vaaia i ata SAM o della global mutants (Fig. 6b). O le mea lea, e suʻesuʻe atili ai le atinaʻeina o le mamanu faʻafanua o le GA faʻailoga i le SAM, matou te faʻaogaina le faʻataʻitaʻiga taimi e iloilo ai le faʻalapotopotoga faʻapitoa o sela i le IPR i le vao-ituaiga (Ler ma Col-0), della global mutants, ma pCUC2 :: gai-1-VENUS transgenic laau.
Na matou iloa o le qmRGA na faʻaalia ai o le GA faʻailoga gaioiga i le IPR na faʻateleina mai le P1 / P2 ma faʻapupulaina i le P4, ma o lenei mamanu na tumau pea i luga o le taimi (Fig. 4a-f ma le Faʻaopoopoga Ata 8c-f, k). Ina ia auiliiliina le faʻalapotopotoga faʻapitoa o sela i le IPR faʻatasi ai ma le faʻateleina o le faailo o le GA, matou te faʻaigoaina le Ler IPR i luga ma itu o le P4 e tusa ai ma o latou atinaʻe faʻataʻitaʻiga na suʻesuʻeina 34 h ina ua maeʻa le matauina muamua, o lona uiga, sili atu ma le lua taimi plastid, e mafai ai ona tatou mulimuli i sela IPR i le taimi o le atinaʻeina o le primordium mai le P1 / P2 i le P4. Na matou faʻaaogaina ni lanu eseese se tolu: samasama mo na sela na tuʻufaʻatasia i totonu o le primordium latalata i le P4, lanu meamata mo i latou sa i totonu o le IPR, ma le lanu viole mo i latou na auai i faiga uma e lua (Fig. 7a-c). I le t0 (0 h), 1-2 laulau o sela IPR na iloa i luma o le P4 (Fig 7a). E pei ona fa'amoemoeina, pe a vaevaeina nei sela, na fa'apea ona faia e ala i le va'aiga fevaevaea'i (Fig. 7a–c). O fa'ai'uga fa'atusa na maua mai i le fa'aogaina o le Col-0 SAM (taula'i i le P3, o lona tuaoi e gaugau tutusa ma le P4 i Ler), e ui lava i lenei genotype o le gaugau na fausia i le tuaoi fuga na natia vave ai sela IPR (Fig. 7g-i). O le mea lea, o le faʻasologa o le vaevaega o sela IPR na muaʻi faʻatulagaina sela i laina radial, e pei o internodes. O le faʻatulagaina o laina radial ma le faʻaogaina o sela IPR i le va o totoga faʻasolosolo e faʻaalia ai o nei sela o le internodal progenitors.
O iinei, na matou atiina ae ai se biosensor faailoilo GA ratiometric, qmRGA, lea e mafai ai ona faʻavasegaina faʻafanua o GA faʻailoga gaioiga e mafua mai i le tuʻufaʻatasia GA ma GA faʻasaʻo tuʻufaʻatasia aʻo faʻaitiitia le faʻalavelave i ala faʻailoga, ma tuʻuina atu faʻamatalaga i luga o galuega GA i le telefoni feaveaʻi. I lea tulaga, na matou fausia ai se porotini DELLA ua suia, mRGA, ua leiloa le malosi e fusifusia ai paaga fegalegaleaiga a DELLA ae o loʻo tumau pea ona nofouta i le GA-induced proteolysis. qmRGA e tali atu i suiga faʻapitoa ma faʻalavelave i le maualuga o le GA, ma o ana mea faʻalogo malosi e mafai ai ona suʻesuʻeina suiga faʻapitoa ile GA faʻailoga gaioiga i le taimi o atinaʻe. O le qmRGA foi ose meafaigaluega e sili ona fetuutuunai aua e mafai ona fetuutuunai i masini eseese e ala i le suia o le faʻalauiloaina o loʻo faʻaaogaina mo lona faʻaaliga (pe a manaʻomia), ma tuʻuina atu le natura faʻasao o le ala faʻailoga GA ma le motif PFYRE i luga o angiosperms, e ono mafai ona faʻafeiloaʻi i isi ituaiga22. E tusa ai ma lenei mea, o se suiga tutusa i le araisa SLR1 DELLA polotini (HYY497AAA) na faʻaalia foi e taofia ai le tuputupu aʻe o le gaioiga o le SLR1 ae na o sina faʻaititia o lona faʻaleagaina GA-mediated, tutusa ma le mRGA23. O le mea moni, o suʻesuʻega talu ai nei i Arabidopsis na faʻaalia ai o le tasi amino acid mutation i le PFYRE domain (S474L) na suia ai le faʻasologa o le RGA e aunoa ma le afaina ai o lona gafatia e fegalegaleai ma paʻaga transcription factor50. E ui lava o lenei suiga e latalata tele i le 3 amino acid sustitutions o loʻo iai i le mRGA, o a matou suʻesuʻega e faʻaalia ai o nei suiga e lua e suia uiga maʻoti o DELLA. E ui lava o le tele o pa'aga fa'asologa o tusitusiga e fusifusia i le LHR1 ma le SAW domains o DELLA26,51, o nisi amino acids fa'asaoina i le PFYRE domain e mafai ona fesoasoani e fa'amautu nei fegalegaleaiga.
O le atina'eina o le totonugalemu ose uiga autu i le fausaga o la'au ma le fa'aleleia atili o fua. qmRGA faʻaalia le maualuga GA faʻailoga gaioiga i totonu ole IPR internode progenitor cell. E ala i le tuʻufaʻatasia o ata faʻataʻitaʻi ma genetics, na matou faʻaalia ai o mamanu faʻailoga GA e faʻapipiʻiina ai vaʻavaʻa vaʻavaʻa / feʻaveaʻi i totonu o le SAM epidermis, faʻapipiʻiina le faʻalapotopotoga vaevaega e manaʻomia mo le atinaʻeina o totonu. E tele fa'atonuga o le va'aiga va'ava'a va'ava'a ua fa'ailoaina i le taimi o le atina'e52,53. O la matou galuega o loʻo tuʻuina atu ai se faʻataʻitaʻiga manino pe faʻafefea ona faʻatonutonuina e le gaioiga faʻailoga GA lenei faʻasologa telefoni. DELLA e mafai ona fegalegaleai ma prefolding protein complexes41, o lea e mafai ai e le faailoina GA ona faʻatonutonu le vaʻaiga vaʻavaʻa vaʻavaʻa e ala i le faʻaogaina saʻo o le cortical microtubule orientation40,41,54,55. Na matou faʻafuaseʻi ona faʻaalia i totonu o le SAM, o le fesoʻotaʻiga o le maualuga o le faʻailoga GA e leʻo le faʻalauteleina o le cell poʻo le vaevaega, ae naʻo le tuputupu aʻe anisotropy, lea e ogatasi ma se aafiaga tuusao o GA i le itu o le vaevaega o le cell i le IPR. Ae ui i lea, e le mafai ona tatou faʻateʻaina o lenei aʻafiaga e mafai foi ona le tuusaʻo, mo se faʻataʻitaʻiga faʻasalalau e GA-faʻaosoina puipui puipui faʻamalulu56. Suiga i totonu o le fale puipui meatotino e faaosofia ai le mamafa o le masini57,58, lea e mafai foi ona aʻafia ai le faʻatulagaina o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa e ala i le aʻafiaina o le faʻaogaina o microtubules cortical39,46,59. O aʻafiaga tuʻufaʻatasia o le faʻamalosia o masini faʻainisinia GA ma le faʻatonuga tuusaʻo o le microtubule orientation e GA e mafai ona aʻafia ai i le fausiaina o se mamanu faʻapitoa o le vaeluaga o le cell orientation i le IPR e faʻamalamalamaina ai le internodes, ma e manaʻomia nisi suʻesuʻega e suʻe ai lenei manatu. I se tulaga talitutusa, o suʻesuʻega talu ai na faʻaalia ai le taua o le DELLA-interacting proteins TCP14 ma le 15 i le puleaina o le internode formation60,61 ma o nei mea e mafai ona faʻatalanoaina le gaioiga a GA faʻatasi ma BREVIPEDICELLUS (BP) ma PENNYWISE (PNY), lea e faʻatonutonu ai le atinaʻeina o le internode ma ua faʻaalia e aʻafia ai le faailoilo GA2,62. Tuuina atu o DELLA e fegalegaleai ma brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, ma abscisic acid (ABA) faailoilo auala63,64 ma o nei hormones e mafai ona aʻafia ai le microtubule orientation65, o aʻafiaga o le GA i luga o le vaeluaga o le cell orientation e mafai foi ona faʻasalalau e isi hormones.
O suʻesuʻega muamua o le cytological na faʻaalia ai o totonu ma fafo o le Arabidopsis SAM e manaʻomia mo le atinaʻeina o le internode2,42. O le mea moni o le GA e faʻatonutonuina le vaeluaga o sela i totonu o masini i totonu12 e lagolagoina ai le lua galuega a GA i le faʻatonutonuina o le meristem ma le internode tele i le SAM. O le mamanu o le vaevaega faʻatonuga o loʻo faʻatulafonoina foi i totonu o le SAM i totonu, ma o lenei tulafono faatonutonu e taua mo le tuputupu aʻe. O le a manaia le suʻesuʻeina pe fai foi GA i se sao i le faʻatulagaina o le vaʻavaʻa vaʻavaʻa i totonu o le SAM faʻalapotopotoga, ma faʻamaopoopoina ai le faʻamatalaga ma le atinaʻeina o internodes i totonu o le SAM.
O laʻau na totōina i totonu o le eleele poʻo le 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) faʻaopoopo i le 1% sucrose ma le 1% agar (Sigma) i lalo o tulaga masani (16 h malamalama, 22 ° C), sei vagana ai le hypocotyl ma aʻa tuputupu aʻe faʻataʻitaʻiga lea na tupu aʻe ai fatu i luga o ipu faʻamau i lalo o le malamalama tumau ma le 22 °C malamalama. Mo suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga, o laʻau na totōina i luga ole MS medium (bioWORLD plant medium) faʻaopoopo i le nitrate lava (0 poʻo 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose ma le 1% A-agar (Sigma) i lalo ole aso umi.
GID1a cDNA fa'aofi i totonu pDONR221 na toe tu'ufa'atasia ma pDONR P4-P1R-pUBQ10 ma pDONR P2R-P3-mCherry i pB7m34GW e fa'atupu ai pUBQ10 :: GID1a-mCherry. IDD2 DNA fa'aofi i totonu pDONR221 na toe tu'ufa'atasia i pB7RWG266 e fa'atupu ai p35S:IDD2-RFP. Ina ia maua le pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b, o le 3.9 kb fragment i luga o le GID1b coding region ma le 4.7 kb fragment o loʻo i ai le GID1b cDNA (1.3 kb) ma le terminator (3.4 kb) na faʻapipiʻiina muamua i le faʻaogaina o le primers i totonu o le PNR1 Faʻaopoopo Faʻatasi 3 (PNR1 Table 3). Fisher Scientific) ma le pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ma mulimuli ane toe tu'ufa'atasia ma le pDONR221 2xmTQ268 i totonu o le pGreen 012567 ve'a fa'aoga e fa'aoga ai le Gateway cloning. Ina ia maua le pCUC2 :: LSSmOrange, o le CUC2 promoter sequence (3229 bp upstream of ATG) sosoo ai ma le coding sequence o Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 ma le N7 nuclear localization signal ma le NOS transcriptional terminator na faʻapipiʻiina i totonu o le pGreen fragment kanamycin system na faʻapipiʻiina i totonu o le pGreen fragment kanamycin system. (Invitrogen). Na fa'aofiina le ve'a fa'ato'aga i totonu o le Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ma fa'afeiloa'i i laulaau Nicotiana benthamiana e ala i le Agrobacterium infiltration method ma le Arabidopsis thaliana Col-0 e ala ile fuga fuga. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ma pCLV3::mCherry-NLS qmRGA na vavae'eseina mai le F3 ma le F1 suli o koluse ta'itasi.
RNA in situ hybridization na faia i luga o le 1 cm le umi o le fana tips72, lea na aoina ma vave faʻapipiʻi i le FAA solution (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) muaʻi malulu i le 4 °C. A maeʻa le 2 × 15 min vacuum treatments, na suia le fixative ma faʻataʻitaʻi faʻataʻitaʻiga i le po. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ma RGL3 cDNAs ma antisense probes ia latou 3'-UTRs na faʻapipiʻiina e faʻaaoga ai faʻamatalaga faʻaalia i le Laulau Faʻaopoopo 3 e pei ona faʻamatalaina e Rosier et al.73. O su'esu'ega fa'aigoa o le Digoxigenin na fa'aigoaina e fa'agata i le fa'aogaina o fa'ama'i o le digoxigenin (3000-dilution; Roche, numera o fa'amaumauga: 11 093 274 910), ma o vaega na pisia i le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-foldlutiontrafoldN0, 250-foldlyl phosphate) / BT2. dilution) fofo.
Taimi meli: Feb-10-2025