Ua Fa'aalia e le Quantitative Gibberellin Biosensor le Matafaioi o Gibberellins i le Fa'amatalaga o Internode i le Shoot Apical Meristem

O le tuputupu aʻe o le apical meristem (SAM) o le fua e taua tele mo le fausaga o au. O homone o laʻaugibberellins(GAs) e faia ni matafaioi taua i le faʻamaopoopoina o le tuputupu aʻe o laʻau, ae o lo latou matafaioi i le SAM e le o malamalama lelei i ai. O iinei, na matou atiaʻe ai se biosensor ratiometric o le GA signaling e ala i le inisinia o le porotini DELLA e taofia ai lana galuega faʻatonutonu taua i le tali atu o le GA transcriptional aʻo faʻasaoina lona faʻaleagaina pe a iloa le GA. Matou te faʻaalia o lenei biosensor e faʻavae i luga o le faʻaleagaina e faʻamaumauina saʻo suiga i le maualuga o le GA ma le lagona o le sela i le taimi o le atinaʻeina. Na matou faʻaaogaina lenei biosensor e faʻafanua ai le gaioiga o faʻailoga GA i le SAM. Matou te faʻaalia o faʻailoga maualuga o le GA e iai tele lava i sela o loʻo i le va o le primordia o totoga, o ni mea muamua i sela internode. I le faʻaaogaina o auala e maua ai ma leiloa ai le galuega, matou te faʻaalia atili ai o le GA e faʻatonutonuina le faʻatulagaina o le vaʻalele vaevaega o sela, faʻatuina ai le faʻatulagaina masani o sela o internodes, ma faʻalauiloa ai le faʻamatalaga o internode i le SAM.
O le shoot apical meristem (SAM), o loʻo i le tumutumu o le shoot, o loʻo i ai se vaega o sela autū o loʻo galulue e faʻatupuina ai totoga faʻalava ma node o le pogai i se auala faʻasolosolo ma faʻasolosolo i le olaga atoa o le laʻau. O nei iunite taʻitasi e toe fai, poʻo node o laʻau, e aofia ai internodes ma totoga faʻalava i nodes, ma axillary meristems i axils o lau1. O le tuputupu aʻe ma le faʻatulagaina o node o laʻau e suia i le taimi o le atinaʻe. I le Arabidopsis, o le tuputupu aʻe internodal e taofia i le taimi o le laʻasaga o le vegetative, ma o axillary meristems e tumau pea le moe i axils o lau rosette. I le taimi o le suiga i le vaega o le fugalaʻau, o le SAM e avea ma meristem o le inflorescence, e faʻatupuina ai internodes faʻaloloa ma axillary buds, lālā i axils o lau cauline, ma mulimuli ane, fugalaʻau e leai ni lau2. E ui lava ua tatou faia ni alualu i luma taua i le malamalama i auala e pulea ai le amataga o lau, fugalaau, ma lala, e itiiti lava se mea e iloa e uiga i le auala e tulaʻi mai ai internodes.
O le malamalama i le tufatufaina atu o GAs i le taimi ma le taimi o le tino o le a fesoasoani e malamalama atili ai i galuega a nei hormones i aano eseese ma i tulaga eseese o le atinaʻe. O le vaʻaia o le faʻaleagaina o le RGA-GFP fusion o loʻo faʻaalia i lalo o le gaioiga a lona lava promoter e maua ai faʻamatalaga taua i le faʻatonutonuina o le aofaʻi o le GA i aʻa15,16. Peitaʻi, e eseese le faʻaalia o le RGA i aano eseese17 ma e faʻatonutonuina e le GA18. O le mea lea, o le eseesega o le faʻaalia o le promoter RGA e ono iʻu ai i le mamanu o le fluorescence e matauina i le RGA-GFP ma o lea e le o se fua faʻatatau lenei metotia. Talu ai nei, o le bioactive fluorescein (Fl)-labeled GA19,20 na faʻaalia ai le faʻaputuina o le GA i le root endocortex ma le faʻatonutonuina o ona tulaga sela e ala i le felauaiga a le GA. Talu ai nei, o le GA FRET sensor nlsGPS1 na faʻaalia ai o tulaga GA e fesoʻotaʻi ma le faʻalauteleina o sela i aʻa, filaments, ma hypocotyls pogisa21. Peitaʻi, e pei ona tatou vaʻaia, o le GA concentration e le na o le pau lea o le parameter e pulea ai le gaioiga o le faʻailoilo a le GA, aua e faʻalagolago i faiga faigata o le lagona. O iinei, e fa'avae i luga o lo matou malamalama i auala fa'ailoilo a le DELLA ma le GA, matou te lipotia atu le atina'eina ma le fa'amatalaina o se biosensor ratiometric e fa'avae i luga o le fa'aleagaina mo le fa'ailoilo a le GA. Mo le atina'eina o lenei biosensor fa'atatau, na matou fa'aogaina se RGA e maaleale i le GA mutant lea na fa'apipi'i i se porotini fluorescent ma fa'aalia i soo se mea i totonu o a'ano, fa'apea fo'i ma se porotini fluorescent e le maaleale i le GA. Matou te fa'aalia o le fa'afefiloi o porotini RGA mutant e le fa'alavelave i le fa'ailoilo a le GA endogenous pe a fa'aalia i soo se mea, ma e mafai e lenei biosensor ona fuaina le gaioiga fa'ailoilo e mafua mai i le ulufale atu o le GA ma le fa'agasologa o fa'ailoilo a le GA e le masini lagona ma le maualuga o le spatiotemporal resolution. Na matou fa'aogaina lenei biosensor e fa'afanua ai le tufatufaina atu o le spatiotemporal o le gaioiga fa'ailoilo a le GA ma fuafua pe fa'apefea ona fa'atonutonu e le GA amioga o le sela i le epidermis SAM. Matou te fa'aalia o le GA e fa'atonutonuina le fa'atulagaina o le va'alele vaevaega o sela SAM o lo'o i le va o le primordia o totoga, ma fa'amatalaina ai le fa'atulagaga masani o le sela o le internode.
I le iuga, na matou fesili pe mafai e le qmRGA ona lipotia suiga i tulaga o le GA i totonu e faʻaaogaina ai hypocotyls o loʻo tuputupu aʻe. Na matou faʻaalia muamua o le nitrate e faʻaosofia ai le tuputupu aʻe e ala i le faʻateleina o le GA synthesis ma, o le iʻuga, o le faʻaleagaina o le DELLA34. O le mea lea, na matou matauina ai o le umi o le hypocotyl i totonu o le pUBQ10::qmRGA o loʻo totoina i lalo o le tele o le nitrate (10 mM NO3−) e sili atu le umi nai lo le umi o le hypocotyl i totonu o le pUBQ10::qmRGA o loʻo totoina i lalo o tulaga e le lava ai le nitrate (Faʻaopoopoga Ata 6a). E ogatasi ma le tali atu i le tuputupu aʻe, o faʻailoga GA e maualuga atu i hypocotyls o le laau na totoina i lalo o tulaga 10 mM NO3− nai lo le laau na totoina e aunoa ma le nitrate (Faʻaopoopoga Ata 6b, c). O le mea lea, e mafai ai foi e le qmRGA ona mataʻituina suiga i faʻailoga GA e mafua mai i suiga i totonu o le GA.
Ina ia malamalama pe o le gaioiga o faailoilo GA na iloa e le qmRGA e faalagolago i le maualuga o le GA ma le iloa o le GA, e pei ona faamoemoeina e faavae i luga o le mamanu o le sensor, na matou iloiloina le faailoaina o le tolu GID1 receptors i totonu o aano o laau ma aano o le toe fanauina. I totonu o laau toto, o le laina o le lipoti a le GID1-GUS na faaalia ai o le GID1a ma le c na maualuga le faailoaina i totonu o cotyledons (Ata 3a–c). E le gata i lea, o receptors uma e tolu na faaalia i totonu o laulaau, o le lateral root primordia, o pito o aʻa (sei vagana ai le pulou aʻa o le GID1b), ma le vascular system (Ata 3a–c). I le inflorescence SAM, na matou iloa ai faailoilo GUS mo na o le GID1b ma le 1c (Ata Faaopoopo 7a–c). O le in situ hybridization na faamaonia ai nei mamanu o faaaliga ma faaalia atili ai o le GID1c na tutusa le faailoaina i tulaga maualalo i le SAM, ae o le GID1b na faaalia ai le maualuga o le faailoaina i le itu o le SAM (Ata Faaopoopo 7d–l). O le pGID1b::2xmTQ2-GID1b translational fusion na faʻaalia ai foʻi se vaega faʻavasegaina o le faʻaalia o le GID1b, mai le maualalo pe leai foʻi o le faʻaalia i le ogatotonu o le SAM i le maualuga o le faʻaalia i tuaoi o totoga (Faʻaopoopoga Ata 7m). O lea la, o GID1 receptors e le o tutusa le tufatufaina i totonu ma totonu o aano. I faʻataʻitaʻiga na sosoo ai, na matou matauina ai foʻi o le soona faʻaalia o le GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) na faʻateleina ai le maaleale o le qmRGA i hypocotyls i le faʻaaogaina i fafo o le GA (Ata 3d, e). I se faʻatusatusaga, o le fluorescence na fuaina e le qd17mRGA i le hypocotyl e le maaleale i le togafitiga o le GA3 (Ata 3f, g). Mo suʻega uma e lua, na togafitia ai laʻau i le maualuga o le GA (100 μM GA3) e iloilo ai le vave o le amio a le sensor, lea na faʻaleleia pe leiloa ai le gafatia e fusifusia ai i le GID1 receptor. Fa'atasi ai, o nei taunuuga ua fa'amaonia ai o le qmRGA biosensor e faia se galuega tu'ufa'atasi o se GA ma se GA sensor, ma fautua mai ai o le eseesega o le fa'aalia o le GID1 receptor e mafai ona fa'atonutonuina ai le emissivity o le sensor.
E oʻo mai i le taimi nei, e le o manino lelei le tufatufaina atu o faʻailoilo GA i le SAM. O le mea lea, na matou faʻaaogaina ai laʻau e faʻaalia ai le qmRGA ma le pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 e fuafua ai faʻafanua faʻatatau maualuga o le gaioiga o faʻailoilo GA, e taulaʻi i le vaega L1 (epidermis; Ata 4a, b, tagaʻi i Metotia ma Metotia Faʻaopoopo), talu ai o le L1 e iai sona sao taua i le puleaina o le tuputupu aʻe o le SAM36. Iinei, o le faʻaalia o le pCLV3::mCherry-NLS na maua ai se faʻasinomaga faʻataʻitaʻi tumau mo le suʻesuʻeina o le tufatufaina atu o le gaioiga o faʻailoilo GA37. E ui lava o le GA e manatu e taua mo le atinaʻeina o totoga i autafa4, na matou matauina o faʻailoilo GA e maualalo i le primordium fugalaʻau (P) e amata mai le tulaga P3 (Ata 4a, b), ae o primordium laiti P1 ma P2 e iai le gaioiga feololo e tutusa ma le vaega tutotonu (Ata 4a, b). O le maualuga o le gaioiga o le fa'ailoilo GA na iloa i tuaoi o le primordium o le totoga, e amata mai i le P1/P2 (i itu o le tuaoi) ma o'o atu i le tumutumuga i le P4, fa'apea fo'i ma sela uma o le vaega pito i tua o lo'o i le va o le primordia (Ata 4a, b ma le Ata Fa'aopoopo 8a, b). O lenei gaioiga maualuga o le fa'ailoilo GA na matauina e le gata i le epidermis ae fa'apea fo'i i le L2 ma le pito i luga o le L3 (Ata Fa'aopoopo 8b). O le mamanu o fa'ailoilo GA na iloa i le SAM e fa'aaoga ai le qmRGA na tumau pea e le'i suia i le aluga o taimi (Ata Fa'aopoopo 8c–f, k). E ui lava o le fausaga qd17mRGA na fa'aitiitia fa'asolosolo i le SAM o la'au T3 mai laina tuto'atasi e lima na matou fa'amatalaina auiliili, ae na mafai ona matou iloiloina mamanu fluorescence na maua i le fausaga pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Ata Fa'aopoopo 8g–j, l). I lenei laina pulea, na'o ni suiga laiti i le fua faatatau o le fluorescence na iloa i le SAM, ae i le ogatotonu o le SAM na matou matauina ai se fa'aitiitia manino ma le le'i mafaufauina i le VENUS e feso'ota'i ma le TagBFP. O lenei mea e faʻamaonia ai o le mamanu faʻailoilo na matauina e le qmRGA o loʻo atagia ai le faʻaleagaina o le mRGA-VENUS e faʻalagolago i le GA, ae faʻaalia ai foʻi e ono soona faʻateleina e le qmRGA le gaioiga faʻailoilo GA i le ogatotonu o le meristem. I se aotelega, o a matou taunuuga o loʻo faʻaalia ai se mamanu faʻailoilo GA e atagia ai le tufatufaina o primordia. O lenei tufatufaina o le vaega i le va o primordial (IPR) e mafua mai i le faʻavaeina malie o le gaioiga faʻailoilo GA maualuga i le va o le primordium o loʻo atiaʻe ma le vaega tutotonu, ae i le taimi lava e tasi e faʻaitiitia ai le gaioiga faʻailoilo GA i le primordium (Ata 4c, d).
O le tufatufaina atu o GID1b ma GID1c receptors (tagai i luga) o loʻo faʻaalia ai o le eseesega o le faʻaalia o GA receptors e fesoasoani e faʻatulaga le mamanu o le gaioiga faʻailoilo GA i le SAM. Sa matou mafaufau pe ono aʻafia ai le faʻaputuga eseese o le GA. Mo le suʻesuʻeina o lenei avanoa, sa matou faʻaaogaina le nlsGPS1 GA FRET sensor21. O le faʻateleina o le faʻagaoioiga na iloa i le SAM o le nlsGPS1 na togafitia i le 10 μM GA4+7 mo le 100 minute (Ata Faʻaopoopo 9a–e), o loʻo faʻaalia ai o le nlsGPS1 e tali atu i suiga i le maualuga o le GA i le SAM, e pei ona faia i aʻa21. O le tufatufaina atu o le nlsGPS1 activation frequency na faʻaalia ai le maualalo o le GA i vaega pito i fafo o le SAM, ae na faʻaalia ai o loʻo siʻitia i le ogatotonu ma i tuaoi o le SAM (Ata 4e ma le Ata Faʻaopoopo 9a,c). O loʻo faʻaalia ai o le GA o loʻo tufatufaina atu foʻi i le SAM ma se mamanu faʻapitoa e tutusa ma le mea na faʻaalia e le qmRGA. I le avea ai o se auala fa'aopoopo, na matou togafitia fo'i le SAM i le fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) po'o le Fl na'o ia o se fa'atonutonu leaga. O le fa'ailo Fl na tufatufa atu i le SAM atoa, e aofia ai le vaega tutotonu ma le primordium, e ui lava i le malosi maualalo (Ata 4j ma le Ata Fa'aopoopo 10d). I se fa'atusatusaga, o GA-Fl uma e tolu na fa'aputuina fa'apitoa i totonu o tuaoi o le primordium ma i tikeri eseese i le vaega o totoe o le IPR, fa'atasi ai ma le GA7-Fl na fa'aputuina i le vaega tele i le IPR (Ata 4k ma le Ata Fa'aopoopo 10a,b). O le fa'atusatusaina o le malosi o le fluorescence na fa'aalia ai o le fua fa'atatau o le malosi o le IPR i le le-IPR e maualuga atu i le SAM na togafitia i le GA-Fl pe a fa'atusatusa i le SAM na togafitia i le Fl (Ata 4l ma le Ata Fa'aopoopo 10c). Fa'atasi ai, o nei taunu'uga e fa'ailoa mai ai o lo'o iai le GA i ni tulaga maualuga i sela IPR o lo'o latalata i le tuaoi o le totoga. O lenei mea e fa'ailoa mai ai o le mamanu o le gaioiga fa'ailo a le SAM GA e mafua mai i le fa'aalia eseese o GA receptors ma le fa'aputuga eseese o GA i sela IPR e lata ane i tuaoi o totoga. O le mea lea, o la matou suʻesuʻega na faʻaalia ai se mamanu spatio-temporal e leʻi mafaufauina o le faʻailoilo a le GA, faʻatasi ai ma le maualalo o le gaioiga i le ogatotonu ma le primordium o le SAM ma le maualuga o le gaioiga i le IPR i le itulagi pito i tua.
Ina ia malamalama i le matafaioi o le eseesega o gaioiga fa'ailoilo GA i le SAM, na matou iloiloina le fesoota'iga i le va o gaioiga fa'ailoilo GA, fa'alauteleina o le sela, ma le vaevaeina o le sela e fa'aaoga ai le ata fa'ata'ita'i taimi moni o le SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Ona o le matafaioi a le GA i le fa'atonutonuina o le tuputupu a'e, na fa'amoemoeina ai se fesoota'iga lelei ma fa'asologa o le fa'alauteleina o le sela. O le mea lea, na matou fa'atusatusa muamua ai fa'afanua o gaioiga fa'ailoilo GA ma fa'afanua o le saoasaoa o le tuputupu a'e o le luga o le sela (e fai ma sui o le malosi o le fa'alauteleina o le sela mo se sela tu'uina atu ma mo sela afafine i le vaeluaga) ma fa'afanua o le anisotropy tuputupu a'e, lea e fuaina ai le itu e fa'alauteleina ai le sela (e fa'aaogaina fo'i iinei mo se sela tu'uina atu ma mo sela afafine i le vaeluaga; Ata 5a,b, taga'i i Metotia ma Metotia Fa'aopoopo). O a matou fa'afanua o le saoasaoa o le tuputupu a'e o le luga o le sela SAM e ogatasi ma matauga muamua38,39, fa'atasi ai ma fua fa'atatau maualalo o le tuputupu a'e i le tuaoi ma fua fa'atatau maualuga o le tuputupu a'e i fugala'au o lo'o atiina a'e (Ata 5a). O le su'esu'ega o vaega autu (PCA) na fa'aalia ai o le gaioiga fa'ailoilo GA e feso'ota'i leaga ma le malosi o le tuputupu a'e o le luga o le sela (Ata 5c). Na matou faʻaalia foʻi o vaega autū o le fesuiaʻiga, e aofia ai le ulufale mai o faʻailoilo GA ma le malosi o le tuputupu aʻe, sa orthogonal i le itu na fuafuaina e le maualuga o le faʻaalia o le CLV3, ma faʻamaonia ai le aveeseina o sela mai le ogatotonu o le SAM i suʻesuʻega o totoe. Na faʻamaonia e le suʻesuʻega o le fesootaʻiga a Spearman ia taunuuga o le PCA (Ata 5d), ma faʻaalia ai o faʻailoilo GA maualuluga i le IPR e leʻi iʻu ai i le faʻalauteleina o le sela. Peitaʻi, o le suʻesuʻega o le fesootaʻiga na faʻaalia ai se fesootaʻiga lelei laʻititi i le va o le gaioiga o faʻailoilo GA ma le anisotropy tuputupu aʻe (Ata 5c, d), ma faʻailoa mai ai o le maualuga o le faʻailoilo GA i le IPR e aʻafia ai le itu o le tuputupu aʻe o le sela ma atonu o le tulaga o le vaʻalele o le vaevaega o le sela.
a, b O fa'afanua vevela o le tuputupu a'e o le fogāeleele (a) ma le anisotropy tuputupu a'e (b) i le SAM na averesi i luga o la'au tuto'atasi e fitu (fa'aaogaina o ni sui mo le malosi ma le itu o le fa'alauteleina o le sela). c O le su'esu'ega PCA na aofia ai fesuia'iga nei: fa'ailo GA, malosi o le tuputupu a'e o le fogāeleele, anisotropy tuputupu a'e o le fogāeleele, ma le fa'aalia o le CLV3. O le vaega PCA 1 sa tele lava ina feso'ota'i lelei ma le malosi o le tuputupu a'e o le fogāeleele ma sa feso'ota'i lelei ma le fa'ailo GA. O le vaega PCA 2 sa tele lava ina feso'ota'i lelei ma le anisotropy tuputupu a'e o le fogāeleele ma sa feso'ota'i leaga ma le fa'aalia o le CLV3. O pasene o lo'o fa'atusalia ai le fesuia'iga na fa'amatalaina e vaega ta'itasi. d Su'esu'ega feso'ota'iga Spearman i le va o le fa'ailo GA, malosi o le tuputupu a'e o le fogāeleele, ma le anisotropy tuputupu a'e o le fogāeleele i le fua o le aano e le aofia ai le CZ. O le numera i le taumatau o le tau o le Spearman rho i le va o fesuia'iga e lua. O fa'ailoga fetu e fa'ailoa mai ai tulaga e matua taua tele ai le feso'ota'iga/le lelei. e 3D va'aiga o sela Col-0 SAM L1 e ala i le microscopy confocal. O puipui fou o sela na fausia i le SAM (ae le o le primordium) i le 10 itula ua valiina e tusa ai ma o latou tau tulimanu. O lo'o fa'aalia le pa lanu i le tulimanu pito i lalo taumatau. O le ata fa'apipi'i o lo'o fa'aalia ai le ata 3D talafeagai i le 0 h. Na toe faia fa'alua le fa'ata'ita'iga ma ni taunuuga tutusa. f O ata o pusa e fa'aalia ai fua faatatau o le vaevaeina o sela i le IPR ma le non-IPR Col-0 SAM (n = 10 la'au tuto'atasi). O le laina ogatotonu e fa'aalia ai le ogatotonu, ma o tuaoi o pusa e fa'aalia ai le 25th ma le 75th percentiles. O whiskers e fa'aalia ai tau maualalo ma maualuga na fuafuaina i le polokalama R. Na maua tau P i le Welch's two-tailed t-test. g, h O le ata fa'ata'ita'i e fa'aalia ai (g) le auala e fuaina ai le tulimanu o le puipui fou o le sela (magenta) e fa'atatau i le itu radial mai le ogatotonu o le SAM (laina pa'epa'e togitogi) (na'o tau tulimanu ma'ai, i.e., 0–90°, e mafaufauina), ma le (h) itu faataamilomilo/itu ma radial i totonu o le meristem. i Histograms masani o le fa'atulagaina o le va'alele o le vaevaeina o sela i luga o le SAM (lanumoana pogisa), IPR (lanumoana feololo), ma le non-IPR (lanumoana malamalama), i le fa'asologa. Na maua tau P e ala i le suega Kolmogorov-Smirnov e lua-si'usi'u. Na toe faia faalua le suega ma ni taunuuga tutusa. j Histograms o le fa'atulagaina o le vaega o le vaevaega o sela o le IPR e siomia ai le P3 (lanumeamata malamalama), P4 (lanumeamata feololo), ma le P5 (lanumeamata pogisa), i le faasologa lava lea. Na maua tau P e ala i le suega Kolmogorov-Smirnov e lua-si'usi'u. Na toe faia faalua le suega ma ni taunuuga tutusa.
O le mea lea, na matou suʻesuʻeina ai le fesootaʻiga i le va o le faʻailoilo a le GA ma le gaioiga o le vaevaega o le sela e ala i le faʻailoaina o puipui o le sela fou na fausia i le taimi o le suʻega (Ata 5e). O lenei auala na mafai ai ona matou fuaina le tele o taimi ma le itu o le vaevaega o le sela. O le mea e ofo ai, na matou iloa ai o le tele o taimi o vaevaega o sela i le IPR ma le vaega o totoe o le SAM (e le o le IPR, Ata 5f) e tutusa, e faʻaalia ai o eseesega i le faʻailoilo a le GA i le va o le IPR ma sela e le o le IPR e le afaina tele ai le vaevaega o le sela. O lenei mea, ma le fesootaʻiga lelei i le va o le faʻailoilo a le GA ma le anisotropy tuputupu aʻe, na mafua ai ona matou mafaufau pe mafai e le gaioiga o le faʻailoilo a le GA ona aʻafia ai le faʻatulagaina o le vaʻalele o le vaevaega o le sela. Na matou fuaina le fa'atulagaga o le puipui fou o le sela i se tulimanu ma'ai e fa'atatau i le radial axis e fa'afeso'ota'i ai le ogatotonu o le meristem ma le ogatotonu o le puipui fou o le sela (Ata 5e-i) ma matauina se aga manino mo sela e vaeluaina i tulimanu e latalata i le 90° e fa'atatau i le radial axis, fa'atasi ai ma le maualuga o le saoasaoa na matauina i le 70–80° (23.28%) ma le 80–90° (22.62%) (Ata 5e,i), e fetaui ma le vaeluaga o sela i le itu fa'ata'amilo/fa'alava (Ata 5h). Ina ia su'esu'eina le sao o le GA signaling i lenei amioga o le vaeluaga o sela, na matou iloiloina ai fa'asologa o le vaeluaga o sela i le IPR ma le non-IPR eseese (Ata 5i). Na matou matauina o le tufatufaina o le tulimanu vaevaeina i totonu o sela IPR e ese mai i sela e le o ni IPR poʻo sela i le SAM atoa, faʻatasi ai ma sela IPR o loʻo faʻaalia ai se vaega maualuga o vaevaega o sela i autafa/faʻataʻamilomilo, e pei o le 70–80° ma le 80–90° (33.86% ma le 30.71%, i le faasologa, o vaega tutusa) (Ata 5i). O lea la, o a matou matauga na faʻaalia ai se sootaga i le va o le maualuga o le faʻailoga GA ma le faʻatulagaina o le vaalele vaevaega o sela e lata ane i le itu faataamilomilo, e tutusa ma le fesootaʻiga i le va o le gaioiga faʻailoga GA ma le anisotropy tuputupu aʻe (Ata 5c, d). Ina ia faʻamautuina atili le faʻasaoina o le avanoa o lenei sootaga, na matou fuaina le faʻatulagaina o le vaalele vaevaega i totonu o sela IPR o loʻo siomia ai le primordium e amata mai le P3, talu ai o le gaioiga faʻailoga GA aupito maualuga na iloa i lenei itulagi e amata mai le P4 (Ata 4). O tulimanu vaevaega o le IPR e siomia ai le P3 ma le P4 e leʻi faʻaalia ai ni eseesega taua faʻamauʻoa, e ui lava o le faʻateleina o le tele o vaevaega o sela i autafa na matauina i le IPR e siomia ai le P4 (Ata 5j). Peita’i, i totonu o sela IPR e lata ane i le P5, o le eseesega i le fa’atulagaina o le va’alele o le vaevaega o sela na avea ma mea taua i fuainumera, fa’atasi ai ma se fa’ateleina tele o le tele o vaevaega o sela (Ata 5j). Fa’atasi ai, o nei taunu’uga e fa’ailoa mai ai e mafai e le fa’ailo GA ona pulea le fa’atulagaina o vaevaega o sela i le SAM, lea e ogatasi ma lipoti na muamua atu40,41 o le maualuga o le fa’ailo GA e mafai ona fa’aosofia ai le fa’atulagaina o vaevaega o sela i le IPR.
Ua valoia o sela i le IPR o le a lē tuufaatasia i totonu o le primordia ae o totonu o internodes2,42,43. O le fa'atulagaina fa'alava o vaevaega o sela i le IPR e ono i'u ai i le fa'atulagaina masani o laina uumi tutusa o sela epidermal i internodes. O a matou matauga o lo'o fa'amatalaina i luga e fautua mai ai o le GA signaling e foliga mai e iai sona sao i lenei faiga e ala i le fa'atonutonuina o le itu o le vaevaega o sela.
O le leiloa o le galuega a le tele o genes DELLA e mafua ai se tali tumau o le GA, ma e mafai ona faʻaaogaina della mutants e faʻataʻitaʻi ai lenei manatu44. Na matou suʻesuʻeina muamua mamanu o le faʻaalia o genes DELLA e lima i le SAM. O le faʻaliliuga o le laina GUS45 na faʻaalia ai o le GAI, RGA, RGL1, ma le RGL2 (i se tulaga itiiti ifo) na faʻaalia i le SAM (Ata Faʻaopoopo 11a–d). O le in situ hybridization na faʻaalia atili ai o le GAI mRNA e faʻaputuina faʻapitoa i primordia ma fugalaau o loʻo atiaʻe (Ata Faʻaopoopo 11e). O le RGL1 ma le RGL3 mRNA na iloa i le canopy atoa o le SAM ma fugalaau matutua, ae o le RGL2 mRNA sa sili atu ona tele i le itulagi tuaoi (Ata Faʻaopoopo 11f–h). O le ata faʻamaonia o le pRGL3::RGL3-GFP SAM na faʻamaonia ai le faʻaalia na matauina e le in situ hybridization ma faʻaalia ai o le porotini RGL3 e faʻaputuina i le vaega tutotonu o le SAM (Ata Faʻaopoopo 11i). I le faʻaaogaina o le laina pRGA::GFP-RGA, na matou iloa ai foi o loʻo faʻaputuina le porotini RGA i le SAM, ae o lona tele e faʻaitiitia i le tuaoi e amata mai le P4 (Ata Faʻaopoopo 11j). E taua tele, o mamanu faʻaalia o le RGL3 ma le RGA e ogatasi ma le maualuga o le gaioiga faʻailoilo GA i le IPR, e pei ona iloa e le qmRGA (Ata 4). E le gata i lea, o nei faʻamaumauga e faʻaalia ai o DELLA uma o loʻo faʻaalia i le SAM ma o latou faʻaalia e aofia uma ai le SAM atoa.
Na matou suʻesuʻeina faʻasologa o le vaevaega o sela i le SAM ituaiga masani (Ler, pulea) ma le gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (lalolagi) mutants (Ata 6a, b). O le mea e ofo ai, na matou matauina se suiga taua i le tufatufaina o le tele o le tulimanu o le vaevaega o sela i le SAM o le della global mutant pe a faʻatusatusa i le ituaiga masani (Ata 6c). O lenei suiga i le della global mutant na mafua mai i le faʻateleina o le tele o tulimanu o le 80–90° (34.71% vs. 24.55%) ma, i se tulaga itiiti ifo, tulimanu o le 70–80° (23.78% vs. 20.18%), o lona uiga, e fetaui ma vaevaega o sela transverse (Ata 6c). O le tele o vaevaega e le o transverse (0–60°) sa maualalo foi i le della global mutant (Ata 6c). O le tele o vaevaega o sela transverse sa matua faʻateleina i le SAM o le della global mutant (Ata 6b). O le tele o vaevaega o sela i le IPR sa maualuga atu foi i le della global mutant pe a faatusatusa i le wild type (Ata 6d). I tua atu o le itulagi o le IPR, o le wild type sa i ai se tufatufaga tutusa o tulimanu o vaevaega o sela, ae o le della global mutant e sili atu ona fiafia i vaevaega tangential e pei o le IPR (Ata 6e). Na matou fuaina foi le fa'atulagaina o vaevaega o sela i le SAM o ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ma le ga2ox6-2), o se GA-inactive mutant background lea e fa'aputu ai le GA. E ogatasi ma le fa’ateleina o le maualuga o le GA, o le SAM o le quintuple ga2ox mutant inflorescence sa sili atu nai lo le Col-0 (Fa’aopoopoga Ata 12a, b), ma pe a fa’atusatusa i le Col-0, o le quintuple ga2ox SAM na fa’aalia ai se tufatufaga ese’ese o tulimanu o le vaevaega o sela, fa’atasi ai ma le fa’ateleina o le tulimanu mai le 50° i le 90°, o lona uiga e toe fiafia i vaevaega tangential (Fa’aopoopoga Ata 12a–c). O lea la, matou te fa’aalia ai o le fa’agaoioiga fa’aauau o le fa’ailoilo a le GA ma le fa’aputuga o le GA e mafua ai le vaevaega o sela i le IPR ma le vaega o totoe o le SAM.
a, b Fa'aaliga 3D o le vaega L1 o le Ler ua valiina i le PI (a) ma le global della mutant (b) SAM e fa'aaoga ai le confocal microscopy. O puipui fou o sela na fausia i le SAM (ae le o le primordium) i le vaitaimi e 10 itula o lo'o fa'aalia ma valiina e tusa ai ma o latou tau tulimanu. O le inset o lo'o fa'aalia ai le SAM i le 0 itula. O le pa lanu o lo'o fa'aalia i le tulimanu pito i lalo taumatau. O le aū i le (b) e fa'asino i se fa'ata'ita'iga o faila o sela ua fa'atulagaina i le global della mutant. Na toe faia fa'alua le fa'ata'ita'iga ma ni taunuuga tutusa. ce fa'atusatusaga o le tufatufaina atu o taimi o fa'atulagaga o le vaevaega o sela i le SAM atoa (d), IPR (e), ma le non-IPR (f) i le va o Ler ma le global della. Na maua tau P e fa'aaoga ai se su'ega Kolmogorov-Smirnov e lua-tailed. f, g Fa'aaliga 3D o ata confocal o le SAM ua valiina i le PI o la'au Col-0 (i) ma pCUC2::gai-1-VENUS (j). O paneli (a, b) o loʻo faʻaalia ai puipui fou o sela (ae le o le primordia) na fausia i le SAM i totonu o le 10 itula. Na toe faia faalua le faʻataʻitaʻiga ma ni taunuuga tutusa. h–j Faʻatusatusaga o le tufatufaina atu o taimi o le vaevaega o sela o loʻo i totonu o le SAM atoa (h), IPR (i) ma le non-IPR (j) i le va o laʻau Col-0 ma pCUC2::gai-1-VENUS. Na maua tau P e faʻaaoga ai le suʻega Kolmogorov–Smirnov e lua-tailed.
Na matou fa'ata'ita'iina le a'afiaga o le taofia o le fa'ailoilo o le GA aemaise lava i le IPR. Mo lenei fa'amoemoe, na matou fa'aaogaina le cotyledon cup 2 (CUC2) promoter e fa'atino ai le fa'aalia o se porotini gai-1 leaga e fa'apipi'i i le VENUS (i le laina pCUC2::gai-1-VENUS). I le SAM ituaiga vao, o le CUC2 promoter e fa'atino ai le fa'aalia o le tele o IPR i le SAM, e aofia ai sela tuaoi, mai le P4 agai i luma, ma o le fa'aalia fa'apitoa tutusa na matauina i la'au pCUC2::gai-1-VENUS (tagai i lalo). O le tufatufaina o tulimanu vaevaega o sela i le SAM po'o le IPR o la'au pCUC2::gai-1-VENUS e le'i matua'i ese lava mai le ituaiga vao, e ui lava na matou iloa ai o sela e leai se IPR i nei la'au na vaeluaina i se taimi maualuga atu o le 80–90° (Ata 6f–j).
Ua fautuaina o le itu o le vaevaega o sela e faalagolago i le foliga o le SAM, aemaise lava le mamafa o le tensile e mafua mai i le pi'o o le aano46. O le mea lea na matou fesiligia ai pe na suia le foliga o le SAM i le della global mutant ma le pCUC2::gai-1-VENUS laau. E pei ona lipotia muamua12, o le tele o le della global mutant SAM e sili atu nai lo le ituaiga vao (Ata Faaopoopo 13a, b, d). O le in situ hybridization o le CLV3 ma le STM RNA na faamaonia ai le faalauteleina o le meristem i della mutants ma faaalia atili ai le faalauteleina i autafa o le stem cell niche (Ata Faaopoopo 13e, f, h, i). Peitai, o le SAM curvature e tutusa i genotypes uma e lua (Ata Faaopoopo 13k, m, n, p). Na matou matauina se faateleina tutusa o le tele i le gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant e aunoa ma se suiga i le pi'o pe a faatusatusa i le ituaiga vao (Ata Faaopoopo 13c, d, g, j, l, o, p). O le tele o le fa'atulagaina o le vaevaega o sela sa a'afia fo'i i le della quadruple mutant, ae i se tulaga itiiti ifo nai lo le della monolithic mutant (Ata Fa'aopoopo 12d–f). O lenei aafiaga o le fua, fa'atasi ai ma le leai o se aafiaga i le pi'o, e fa'ailoa mai ai o le gaioiga o le RGL3 o totoe i le Della quadruple mutant e fa'atapula'aina ai suiga i le fa'atulagaina o le vaevaega o sela e mafua mai i le leiloa o le gaioiga a le DELLA ma o suiga i vaevaega o sela i autafa e tutupu e tali atu i suiga i le gaioiga fa'ailoilo a le GA nai lo suiga i le geometry SAM. E pei ona fa'amatalaina i luga, o le CUC2 promoter e fa'amalosia ai le fa'aalia o le IPR i le SAM e amata mai le P4 (Ata Fa'aopoopo 14a, b), ma i se fa'atusatusaga, o le pCUC2::gai-1-VENUS SAM sa i ai se lapo'a fa'aitiitia ae maualuga le pi'o (Ata Fa'aopoopo 14c–h). O lenei suiga i le morphology o le pCUC2::gai-1-VENUS SAM e ono i'u ai i se tufatufaina ese o fa'alavelave fa'amekanika pe a fa'atusatusa i le ituaiga vao, lea e amata ai fa'alavelave maualuga i se mamao pu'upu'u mai le ogatotonu o le SAM47. I se isi itu, o suiga i le foliga o le pCUC2::gai-1-VENUS SAM e ono mafua mai i suiga i meatotino fa'aitulagi fa'aitulagi e mafua mai i le fa'aalia o le transgene48. I tulaga uma e lua, e mafai ona fa'aitiitia ai sina vaega o a'afiaga o suiga i le fa'ailoilo a le GA e ala i le fa'ateleina o le ono vaeluaina o sela i le fa'atulagaga fa'ata'amilosaga/fa'alava, e fa'amatalaina ai a matou matauga.
A tuufaatasia, o a matou faamaumauga ua faamaonia ai o le maualuga o le GA signaling e iai sona sao taua i le itu agai i luma o le vaega o le vaevaega o sela i le IPR. Latou te faaalia foi o le pi'o o le meristem e aafia ai foi le itu agai i luma o le vaega o le vaevaega o sela i le IPR.
O le fa'asinomaga fa'alava o le va'alele vaevaega i le IPR, ona o le maualuga o le gaioiga fa'ailoilo a le GA, e fa'ailoa mai ai o le GA e fa'atulaga muamua se faila sela radial i le epidermis i totonu o le SAM e fa'amatalaina ai le fa'atulagaga o sela lea o le a mulimuli ane maua i le internode epidermal. O le mea moni, o ia faila sela sa masani ona va'aia i ata SAM o della global mutants (Ata 6b). O le mea lea, ina ia su'esu'e atili ai le galuega fa'atino o le mamanu fa'ale-spatial o le fa'ailoilo a le GA i le SAM, na matou fa'aogaina ai le fa'ata'ita'iga taimi-lapse e iloilo ai le fa'atulagaga fa'ale-spatial o sela i le IPR i le wild-type (Ler ma Col-0), della global mutants, ma pCUC2::gai-1-VENUS transgenic plants.
Na matou iloa o le qmRGA na faʻaalia ai o le gaioiga o faʻailoilo GA i le IPR na faʻateleina mai le P1/P2 ma oʻo atu i le tumutumuga i le P4, ma o lenei mamanu na tumau pea i le aluga o taimi (Ata 4a–f ma le Ata Faʻaopoopo 8c–f, k). Ina ia iloiloina le faʻatulagaga faʻapitoa o sela i le IPR faʻatasi ai ma le faʻateleina o le faʻailoilo GA, na matou faʻailogaina sela Ler IPR i luga ma itu o le P4 e tusa ai ma lo latou iʻuga o le atinaʻe na iloiloina i le 34 itula talu ona vaʻaia muamua, o lona uiga, e sili atu ma le lua taimi plastid, ma mafai ai ona matou mulimuli i sela IPR i le taimi o le atinaʻeina o le primordium mai le P1/P2 i le P4. Na matou faʻaaogaina lanu eseese e tolu: samasama mo na sela na tuʻufaʻatasia i le primordium e lata ane i le P4, lanumeamata mo i latou na i totonu o le IPR, ma le violē mo i latou na auai i faiga uma e lua (Ata 7a–c). I le t0 (0 h), e 1–2 vaega o sela IPR na vaʻaia i luma o le P4 (Ata 7a). E pei ona faʻamoemoeina, ina ua vaeluaina nei sela, na latou faia tele lava e ala i le vaalele vaevaega transverse (Ata 7a–c). Na maua ni taunuuga faapena e ala i le faaaogaina o le Col-0 SAM (e taula’i atu i le P3, o lona tuaoi e gaugau tutusa ma le P4 i le Ler), e ui lava i lenei genotype o le gaugau na fausia i le tuaoi o fugalaau e vave ona natia ai sela IPR (Ata 7g–i). O lea la, o le mamanu o le vaevaeina o sela IPR e muai faatulagaina ai sela i ni laina radial, e pei o internodes. O le faatulagaina o laina radial ma le nofoaga o sela IPR i le va o totoga sosoo e fautua mai ai o nei sela o ni tupuaga internodal.
Iinei, na matou atiaeina ai se ratiometric GA signaling biosensor, qmRGA, lea e mafai ai ona fa'afanua fa'atatau o le gaioiga fa'ailoilo GA e mafua mai i le tu'ufa'atasia o le GA ma le GA receptor a'o fa'aitiitia ai le fa'alavelave i auala fa'ailoilo endogenous, ma tu'uina atu ai fa'amatalaga i le galuega a le GA i le tulaga o le sela. Mo lenei fa'amoemoe, na matou fausia ai se porotini DELLA ua suia, mRGA, lea ua leiloa le gafatia e fusifusia ai pa'aga fegalegaleai a le DELLA ae tumau pea le maaleale i le proteolysis e mafua mai i le GA. E tali atu le qmRGA i suiga i fafo ma totonu i tulaga o le GA, ma o ona uiga fa'alagona fa'aolaola e mafai ai ona iloilo suiga spatiotemporal i gaioiga fa'ailoilo GA i le taimi o le atina'e. O le qmRGA o se meafaigaluega e matua fetu'una'i lava aua e mafai ona fetu'una'i i a'ano eseese e ala i le suia o le promoter e fa'aaogaina mo lona fa'aalia (pe a mana'omia), ma ona o le natura fa'asaoina o le auala fa'ailoilo GA ma le PFYRE motif i luga o angiosperms, e foliga mai e mafai ona fa'aliliuina atu i isi ituaiga22. E ogatasi ma lenei mea, o se fesuiaʻiga tutusa i le porotini araisa SLR1 DELLA (HYY497AAA) na faʻaalia foi e taofia ai le gaioiga o le tuputupu aʻe o le SLR1 ae na o sina faʻaitiitia ai lona faʻaleagaina e mafua mai i le GA, e tutusa ma le mRGA23. E taua tele, o suʻesuʻega talu ai nei i le Arabidopsis na faʻaalia ai o le fesuiaʻiga e tasi o le amino acid i le PFYRE domain (S474L) na suia ai le gaioiga faʻaliliuina o le RGA e aunoa ma le aʻafia ai o lona gafatia e fegalegaleai ma paʻaga transcription factor50. E ui o lenei fesuiaʻiga e matua latalata lava i le 3 amino acid sui o loʻo iai i le mRGA, o a matou suʻesuʻega e faʻaalia ai o nei fesuiaʻiga e lua e suia ai uiga eseese o le DELLA. E ui o le tele o paʻaga transcription factor e fusifusia i le LHR1 ma le SAW domains o le DELLA26,51, o nisi amino acids faʻasaoina i le PFYRE domain e mafai ona fesoasoani e faʻamautu nei fegalegaleaiga.
O le atina'eina o le internode o se uiga autū i le fausaga o la'au ma le fa'aleleia atili o le fua. Na fa'aalia e le qmRGA le maualuga o le gaioiga o fa'ailoilo GA i totonu o sela progenitor internode IPR. I le tu'ufa'atasia o ata fa'atusa ma genetics, na matou fa'aalia ai o mamanu fa'ailoilo GA e fa'apipi'i ai va'alele vaevaega sela fa'ata'amilomilo/fa'alava i totonu o le epidermis SAM, ma fa'atulagaina ai le fa'atulagaga o le vaevaega sela e mana'omia mo le atina'eina o le internode. E tele fa'atonutonu o le fa'atulagaina o le va'alele vaevaega sela ua fa'ailoaina i le taimi o le atina'eina52,53. O la matou galuega e maua ai se fa'ata'ita'iga manino o le auala e fa'atonutonu ai e le gaioiga o fa'ailoilo GA lenei parakalafa sela. E mafai e le DELLA ona fegalegaleai ma fa'alavelave porotini muamua41, o lea e mafai ai e le fa'ailoilo GA ona fa'atonutonu le fa'atulagaina o le va'alele vaevaega sela e ala i le fa'atosina sa'o o le fa'atulagaina o le cortical microtubule40,41,54,55. Na matou fa'aalia fa'afuase'i i le SAM, o le feso'ota'iga o le maualuga o le gaioiga o fa'ailoilo GA e le o le fa'alauteleina o le sela po'o le vaevaega, ae na'o le anisotropy tuputupu a'e, lea e ogatasi ma se aafiaga tuusa'o o le GA i le itu o le vaevaega o le sela i le IPR. Peita'i, e le mafai ona matou fa'ate'aina o lenei aafiaga e mafai fo'i ona le tuusa'o, mo se fa'ata'ita'iga e fa'aosofia e le fa'amaluluina o le puipui o le sela e mafua mai i le GA56. O suiga i meatotino o le puipui o le sela e mafua ai le atuatuvale fa'amekanika57,58, lea e mafai foi ona a'afia ai le fa'atulagaina o le va'alele vaevaega o le sela e ala i le a'afia ai o le fa'atulagaina o microtubules cortical39,46,59. O aafiaga tu'ufa'atasi o le atuatuvale fa'amekanika e mafua mai i le GA ma le fa'atonutonuina sa'o o le fa'atulagaina o microtubule e le GA atonu e aofia ai i le fa'atupuina o se mamanu fa'apitoa o le fa'atulagaina o le vaevaega o le sela i le IPR e fa'amatalaina ai internodes, ma e mana'omia nisi su'esu'ega e fa'ata'ita'i ai lenei manatu. I se tulaga tutusa, o su'esu'ega na muamua atu na fa'amamafaina ai le taua o porotini e fegalegaleai ma le DELLA o le TCP14 ma le 15 i le puleaina o le fausiaina o internode60,61 ma o nei mea e ono fa'alavelaveina ai le gaioiga a le GA fa'atasi ai ma le BREVIPEDICELLUS (BP) ma le PENNYWISE (PNY), lea e fa'atonutonuina ai le atina'eina o internode ma ua fa'aalia e a'afia ai le fa'ailoilo o le GA2,62. Ona o le fegalegaleai o DELLA ma auala fa'ailoilo o le brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, ma le abscisic acid (ABA)63,64 ma e mafai e nei hormones ona fa'aosofia le fa'atulagaina o microtubule65, o a'afiaga o le GA i le fa'atulagaina o le vaevaega o sela e mafai fo'i ona fa'atinoina e isi hormones.
O suʻesuʻega muamua o le cytology na faʻaalia ai e manaʻomia vaega i totonu ma fafo o le Arabidopsis SAM mo le atinaʻeina o internode2,42. O le mea moni e faʻatonutonuina e le GA le vaeluaga o sela i totonu o aano12 e lagolagoina ai le galuega lua a le GA i le faʻatonutonuina o le meristem ma le tele o internode i le SAM. O le mamanu o le vaeluaga o sela i le itu e faʻatonutonuina lelei foi i totonu o le aano SAM i totonu, ma o lenei faʻatonutonuina e taua tele mo le tuputupu aʻe o le au52. O le a manaia le suʻesuʻeina pe iai foʻi se sao o le GA i le faʻatulagaina o le vaʻalele o le vaeluaga o sela i totonu o le faʻatulagaga o le SAM i totonu, ma faʻapea ona faʻafetaui ai le faʻamatalaga ma le atinaʻeina o internodes i totonu o le SAM.
Sa totoina laau i totonu o le vitro i le eleele po o le 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) faaopoopo i le 1% sucrose ma le 1% agar (Sigma) i lalo o tulaga masani (16 itula le malamalama, 22 °C), vagana ai faataitaiga o le hypocotyl ma le tuputupu ae o aa lea na totoina ai laau laiti i luga o ipu faatulagaina i lalo o le malamalama faifai pea ma le 22 °C. Mo faataitaiga o le nitrate, sa totoina laau i luga o le modified MS medium (bioWORLD plant medium) faaopoopo i le nitrate talafeagai (0 po o le 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose ma le 1% A-agar (Sigma) i lalo o tulaga o le aso umi.
O le GID1a cDNA na tu'uina i totonu o le pDONR221 na toe tu'ufa'atasia ma le pDONR P4-P1R-pUBQ10 ma le pDONR P2R-P3-mCherry i totonu o le pB7m34GW e fa'atupu ai le pUBQ10::GID1a-mCherry. O le IDD2 DNA na tu'uina i totonu o le pDONR221 na toe tu'ufa'atasia i totonu o le pB7RWG266 e fa'atupu ai le p35S:IDD2-RFP. Ina ia gaosia le pGID1b::2xmTQ2-GID1b, o se fasi vaega e 3.9 kb i luga a'e o le vaega fa'ailoga GID1b ma se fasi vaega e 4.7 kb o lo'o i ai le GID1b cDNA (1.3 kb) ma le terminator (3.4 kb) na muamua fa'ateleina e fa'aaoga ai primers i le Supplementary Table 3 ona fa'aofi lea i totonu o le pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ma le pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ma mulimuli ane toe tu'ufa'atasia ma le pDONR221 2xmTQ268 i totonu o le pGreen 012567 target vector e fa'aaoga ai le Gateway cloning. Ina ia gaosia le pCUC2::LSSmOrange, o le faasologa o le CUC2 promoter (3229 bp i luga atu o le ATG) sosoo ai ma le faasologa o le coding o le Stokes-shifted mOrange tetele (LSSmOrange)69 faatasi ai ma le faailoilo o le N7 nuclear localization ma le NOS transcriptional terminator na tuufaatasia i totonu o le pGreen kanamycin targeting vector e faaaoga ai le Gateway 3-fragment recombination system (Invitrogen). O le vector binary o le laau na faaofiina i totonu o le Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ma faaofiina i totonu o lau o Nicotiana benthamiana e ala i le metotia o le Agrobacterium infiltration ma i totonu o le Arabidopsis thaliana Col-0 e ala i le metotia o le floral dip, i le faasologa. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ma le pCLV3::mCherry-NLS qmRGA na vavaeeseina mai fanau F3 ma le F1 o koluse taitasi.
Sa faia le RNA in situ hybridization i luga o tumutumu o le au e tusa ma le 1 cm le umi72, ia na aoina ma fa'amauina loa i le vaila'au FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) ma fa'amālūlūina muamua i le 4 °C. A mae'a togafitiga e 2 × 15 minute i le vacuum, sa suia le fixative ma fa'atumauina fa'ata'ita'iga i le po atoa. O GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ma le RGL3 cDNAs ma antisense probes i a latou 3′-UTRs sa fa'aputuina e fa'aaoga ai primers o lo'o fa'aalia i le Supplementary Table 3 e pei ona fa'amatalaina e Rosier et al.73. O su'ega ua fa'ailogaina i le Digoxigenin na iloa ai le puipuiga o le tino e fa'aaoga ai antibodies digoxigenin (3000-fold dilution; Roche, numera o le lisi: 11 093 274 910), ma o vaega na valiina i le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-fold dilution)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200-fold dilution) solution.