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O le mauaina ma le faʻaaogaina lelei o oloa masani e mafai ona fesoasoani e faʻaleleia atili ai le soifuaga o tagata. O vailaʻau e taofia ai le tuputupu aʻe o laʻau e faʻaaogaina lautele e fai ma vailaʻau faʻasaina vao e pulea ai vao. Ona o le manaʻomia ona faʻaaoga ituaiga eseese o vailaʻau faʻasaina vao, e manaʻomia ai ona faʻailoa ni vailaʻau faʻatasi ai ma ni auala fou e faʻatino ai. I lenei suʻesuʻega, na matou maua ai se vailaʻau fou o le N -alkoxypyrrole, o le coumamonamide, mai le Streptomyces werraensis MK493-CF1 ma faʻatuina ai le faagasologa atoa o le faʻaputuga. E ala i suʻega o gaioiga faʻaola, na matou iloa ai o le urs-monoamic acid o se vailaʻau faʻasaina o le urs-monoamide ma se mea e ono mafai ona faʻaaogaina.mea e taofia ai le tuputupu aʻe o laʻau. E le gata i lea, ua matou atiaeina ni vailaʻau eseese e maua mai i le urbenonic acid, e aofia ai le urbenyloxy derivative (UDA), lea e maualuga lona aafiaga e faʻaumatia ai laau e aunoa ma se aʻafiaga leaga i le tuputupu aʻe o sela HeLa. Na matou iloa foi o vailaʻau e maua mai i le urmotonic acid e faʻalavelaveina ai microtubules o laau; e le gata i lea, e aʻafia e le KAND ia actin filaments ma mafua ai le oti o sela; O nei aafiaga e tele ona itu e ese mai i aafiaga o microtubule inhibitors ua iloa ma fautua mai ai se faiga fou o le gaioiga mo le ursonic acid, lea e fai ma sui taua i le atinaʻeina o vailaʻau fou e faʻaumatia ai laau.
O le mauaina ma le faʻaaogaina moni o oloa faʻalenatura aoga ma a latou mea e maua mai ai o se auala lea e faʻaleleia atili ai le tulaga lelei o le soifuaga o tagata. O metabolites lona lua e gaosia e meaola ninii, laʻau ma iniseti ua taitai atu ai i ni alualu i luma tetele i vailaʻau ma faʻatoʻaga. E tele vailaʻau faʻamaʻi ma vailaʻau e teteʻe ai i le leukemia ua atiaʻe mai oloa faʻalenatura. E le gata i lea, o ituaiga eseese ovaila'au fa'asaina, o vailaau fa'amate ma vaila'au fa'amate vao e maua mai nei oloa masani mo le fa'aaogaina i fa'ato'aga. Ae maise lava, o vaila'au fa'amate vao e pulea ai vao o ni meafaigaluega taua mo le fa'ateleina o fua o fa'ato'aga i fa'ato'aga fa'aonaponei, ma o ituaiga eseese o vaila'au ua uma ona fa'aaogaina fa'apisinisi. O le tele o faiga o sela i totonu o la'au, e pei o le photosynthesis, metabolism amino acid, synthesis cell wall, regulation of mitosis, phytohormone signaling, po'o le protein synthesis, e manatu o ni sini masani o vaila'au fa'amate vao. O vaila'au e taofia ai le galuega a le microtubule o se vasega masani o vaila'au fa'amate vao e a'afia ai le tuputupu a'e o la'au e ala i le a'afia ai o le mitotic regulation2.
O Microtubules o vaega ia o le cytoskeleton ma e fa'asaoina lautele i totonu o sela eukaryotic. O le tubulin heterodimer e aofia ai le α-tubulin ma le β-tubulin e fausia ai ni protofilaments microtubule linear, fa'atasi ai ma le 13 protofilaments e fausia ai se fausaga cylindrical. E tele matafaioi a Microtubules i totonu o sela o la'au, e aofia ai le fuafuaina o le foliga o le sela, vaevaega o sela, ma le felauaiga i totonu o le sela3,4. O lo'o iai i totonu o sela o la'au ni microtubules i lalo o le membrane plasma interphase, ma o nei mea ua ta'ua o cortical microtubules e manatu e pulea le fa'atulagaina o cellulose microfibrils e ala i le fa'atonutonuina o cellulose synthase complexes4,5. O cortical microtubules o sela epidermal o a'a, o lo'o iai i le sone o le vave fa'alauteleina o le pito o le a'a, o lo'o i autafa, ma o cellulose microfibers e mulimuli i nei microtubules ma fa'atapula'aina le itu o le fa'alauteleina o le sela, ma fa'alauiloa ai le fa'alauteleina o le sela anisotropic. O le mea lea, o le galuega a microtubule e feso'ota'i vavalalata ma le morphology o la'au. O le suia o amino acid i totonu o genes o loʻo faʻailoa mai ai le tubulin e mafua ai le faʻaletonu o le cortical microtubule arrays ma le tuputupu aʻe i le itu agavale poʻo le itu taumatau i le Arabidopsis 6,7. E faʻapena foʻi, o suiga i porotini e fesoʻotaʻi ma microtubule e faʻatonutonuina ai le gaioiga a le microtubule e mafai foʻi ona oʻo atu ai i le faʻaletonu o le tuputupu aʻe o aʻa8,9,10,11,12,13. E le gata i lea, o togafitiga i vailaʻau faʻasaina e faʻalavelave ai le microtubule e pei o le disopyramide, e taʻua foʻi o le pretilachlor, e mafua ai foʻi le tuputupu aʻe o aʻa i le itu tauagavale14. O nei faʻamaumauga e faʻaalia ai o le faʻatonutonuina saʻo o le galuega a le microtubule e taua tele mo le fuafuaina o le itu e tuputupu aʻe ai le laʻau.
Ua maua ituaiga eseese o microtubule inhibitors, ma o nei vailaau ua i ai se sao taua i suʻesuʻega o le cytoskeletal, faapea foi i faatoaga ma vailaau faafomai2. Ae maise lava, o le oryzalin, dinitroaniline compounds, disopyramide, benzamide-related compounds, ma a latou analogs e mafai ona taofia ai le galuega a le microtubule ma faapea ona taofia ai le tuputupu aʻe o laau. O le mea lea, e lautele lo latou faaaogaina o ni vailaau faasaina. Peitai, talu ai o microtubules o se vaega taua o sela o laau ma manu, o le tele o microtubule inhibitors e cytotoxic i ituaiga uma e lua o sela. O le mea lea, e ui lava i lo latou aoga ua iloa o ni vailaau faasaina, ae o se numera faatapulaaina o vailaau faasaina e faaaogaina mo faamoemoega aoga.
O le Streptomyces o se ituaiga o le aiga o le Streptomyces, e aofia ai siama aerobic, gram-positive, filamentous ma ua lauiloa lautele i lona gafatia e gaosia ai le tele o metabolites lona lua. O le mea lea, ua manatu o se tasi o punaoa sili ona taua o oloa faanatura fou e aoga i meaola. I le suʻesuʻega o loʻo iai nei, na matou maua ai se vailaʻau fou e taʻua o le coumamonamide, lea na vavaeʻeseina mai le Streptomyces werraensis MK493-CF1 ma le S. werraensis ISP 5486. I le faʻaaogaina o le suʻesuʻega spectral ma le suʻesuʻega atoa o le spectral, na faʻamatalaina ai le fausaga o le coumamonamide ma na fuafuaina ai lona tino tulaga ese o le N-alkoxypyrrole. O le Ursmonic acid, o se vailaʻau faʻapitoa o le ursmonoamide ma ona mea e maua mai ai, na maua e taofia ai le tuputupu aʻe ma le tuputupu aʻe o le laʻau lauiloa o le Arabidopsis thaliana. I se suʻesuʻega o le sootaga o le fausaga ma le gaioiga, na matou maua ai o se vailaʻau ma le C9 ua suia i le ursonic acid, e taʻua o le nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), e faʻaleleia atili ai le aafiaga faʻalavelave i le tuputupu aʻe ma le tuputupu aʻe. E tāua tele, o le mea fou na maua e taofia ai le tuputupu aʻe o laʻau na aʻafia ai foʻi le tuputupu aʻe o le tapaa ma le liverwort ma e leʻi afaina ai siama poʻo sela HeLa. E le gata i lea, o nisi o mea e maua mai i le urmotonic acid e mafua ai se faʻaletonu o le phenotype o aʻa, o lona uiga o nei mea e maua mai e aʻafia tuusaʻo pe le tuusaʻo foʻi microtubules. E ogatasi ma lenei manatu, o a matou matauga i microtubules ua faʻailogaina i le immunohistochemicals poʻo le fluorescent proteins e faʻaalia ai o le togafitiga a le KAND e faʻaitiitia ai le polymerization o microtubules. E le gata i lea, o togafitiga i mea e maua mai i le kumamotonic acid na faʻalavelaveina ai actin microfilaments. O lea la, ua matou maua ai se mea fou e taofia ai le tuputupu aʻe o laʻau o lona faiga tulaga ese o le gaioiga e aofia ai le faʻaumatia o le cytoskeleton.
Na vavaeʻeseina le ituaiga MK493-CF1 mai le eleele i Shinagawa-ku, Tokyo. Na fausia e le ituaiga MK493-CF1 se mycelium stromal e lelei ona lālā. Na fuafuaina le faʻasologa faʻasolosolo o le 16S ribosomal RNA gene (1422 bp). E tutusa lelei lava lenei ituaiga ma le S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ituaiga masani, 99.93%). E faʻavae i luga o lenei taunuuga, na iloa ai o lenei ituaiga e fesoʻotaʻi vavalalata ma le ituaiga ituaiga o le S. werraensis. O le mea lea, na matou faaigoaina ai lenei ituaiga o le S. werraensis MK493-CF1. E gaosia foʻi e le S. werraensis ISP 5486T ia lava vailaʻau faʻapitoa. Talu ai e le tele ni suʻesuʻega vave i le mauaina o oloa masani mai lenei meaola ninii, na faia ai nisi suʻesuʻega faʻakemikolo. A maeʻa ona totoina le S. werraensis MK493-CF1 i luga o le karite e ala i le faʻafefeteina o le tulaga mautu i le 30°C mo le 14 aso, ona faʻamamāina lea o le karite i le 50% EtOH. E 60 ml o le faʻataʻitaʻiga na faʻamago ina ia maua ai le 59.5 mg o le mea manogi. O le mea manogi na faʻamamāina na faia i le reverse phase HPLC e maua ai le N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, e igoa ia coumamonamide, 36.0 mg). O le aofaʻi atoa o le 1 e tusa ma le 60% o le mea manogi. O le mea lea, na matou filifili ai e suʻesuʻe auiliili meatotino o le kumamotoamide 1.
O le Coumamonamide 1 o se pauta paʻepaʻe amorphous ma o le maualuga o le resolution mass spectrometry (HRESIMS) ua faʻamaonia ai le C6H8N2O2 (Ata 1). O le vaega pyrrole ua suia e le C2 o lenei faʻaputuga e faʻailoaina e le δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH i le 1H NMR spectrum: 4.5 Hz, H-5) ma le δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ma o le 13C NMR spectrum e faʻaalia ai le i ai o atomu kaponi sp2 e fa. O le i ai o se vaega amide i le tulaga C2 na iloiloina e ala i le HMBC correlation mai le C-3 proton i le amide carbonyl carbon i le δC 161.1. E le gata i lea, o tumutumuga 1 H ma le 13 C NMR i le δH 4.10 (3H, S) ma le δC 68.3 e faʻaalia ai le i ai o vaega N-methoxy i totonu o le molecule. E ui lava e leʻi iloa le tulaga saʻo o le vaega methoxy e ala i le faʻaaogaina o le auʻiliʻiliga spectroscopic e pei o le enhanced difference spectroscopy ma le nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), ae na avea le N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ma uluai sui tauva.
Ina ia iloa le fausaga sa'o o le 1, na faia ai se fa'asologa atoa (Ata 2a). O le togafitiga o le 2-aminopyridine 2 o lo'o maua fa'apisinisi i le m-CPBA na mafua ai le N-oxide 3 tutusa i le fua fa'atatau. A mae'a le 2-aminoazidation o le 2, o le tali atu o le cyclocondensation na fa'amatalaina e Abramovich na faia i le benzene i le 90°C e maua ai le 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 e mana'omia i le kalama. Saosaoa 60% (vaega e lua). 15,16. Ona maua ai lea e le Methylation ma le hydrolysis o le 4 le 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (ua ta'ua o le "cumotonic acid", 6) i le fua lelei (70%, laasaga e lua). Mulimuli ane, o le amidation e ala i le acid chloride intermediate 6 e fa'aaoga ai le aqueous ammonia na maua ai e le Kumamoto amide 1 i le 98% fua. O fa'amaumauga uma o le synthesized 1 e tutusa ma le 1 na vavae'eseina, o lea na fuafuaina ai le fausaga o le 1;
Fa'asologa lautele ma le au'ili'iliga o le gaioiga fa'aola o le urbenamide ma le urbenic acid. (a) Fa'asologa atoa o le Kumamoto amide. (b) O la'au vao Arabidopsis Columbia (Col) e fitu aso le matutua na totōina i luga o ipu Murashige ma Skoog (MS) o lo'o i ai le coumamonamide 6 po'o le coumamonamide 1 i le maualuga ua fa'ailoa mai. Pa fua = 1 cm.
Muamua, na matou iloiloina gaoioiga fa'aola o le urbenamide ma ona vaila'au fa'asolosolo mo lo latou gafatia e fa'atonutonu ai le tuputupu a'e o la'au. Na matou fa'aopoopoina ni fa'aputuga eseese o le ursmonamide 1 po'o le ursmonic acid 6 i le MS agar medium ma totoina ai la'au Arabidopsis thaliana i luga o lenei medium. O nei su'ega na fa'aalia ai o le maualuga o le fa'aputuga (500 μM) o le 6 na taofia ai le tuputupu a'e o a'a (Ata 2b). Sosoo ai, na matou faia ni mea e maua mai i le suia o le tulaga N1 o le 6 ma faia ni su'esu'ega o le sootaga o le fausaga ma le gaioiga i luga o ia mea (o le faiga o le fa'aputuga fa'asolosolo o lo'o fa'amatalaina i le Fa'amatalaga Lagolago (SI)). Na totoina la'au Arabidopsis i luga o se medium o lo'o i ai le 50 μM ursonic acid derivatives, ma fuaina le umi o a'a e pei ona fa'aalia i le ata. E pei ona fa'aalia i Ata 3a, b, ma le S1, o coumamo acids e eseese umi o filifili alkoxy linear (9, 10, 11, 12, ma le 13) po'o filifili alkoxy tetele (15, 16, ma le 17) i le tulaga N1. O mea e maua mai ai na faaalia ai le taofiofia tele o le tuputupu aʻe o aʻa. E le gata i lea, na matou iloa ai o le faʻaaogaina o le 200 μM 10, 11, poʻo le 17 na taofia ai le tuputupu aʻe o aʻa (Ata 3c ma le S2).
Su'esu'ega o le sootaga o le fausaga ma le gaioiga o le Kumamoto amide ma vaila'au fa'atatau. (a) Fuafuaga o le fausaga ma le tu'ufa'atasiga o mea fa'atusa. (b) Fuafuaina o le umi o a'a o la'au e 7-aso le matutua na totoina i luga o le MS medium ma pe leai fo'i le 50 μM coumamonamide derivatives. O fa'ailoga fetu e fa'aalia ai eseesega taua ma togafitiga pepelo (t test, p< 0.05). n>18. O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o le averesi ± SD. O le nt o lona uiga "e le'i fa'ata'ita'iina" aua e sili atu i le 50% o fatu e le'i totogo. (c) Fuafuaina o le fua faatatau o le totogo o fatu ua togafitia na fa'asusu mo le 7 aso i le MS medium fa'atasi ai pe leai fo'i le 200 μM coumamonamide ma vaila'au fa'atatau. O fa'ailoga fetu e fa'aalia ai eseesega taua ma togafitiga fa'asese (chi-square test). n=96.
O le mea e malie ai, o le faʻaopoopoina o filifili itu alkyl e umi atu nai lo le C9 na faʻaitiitia ai le gaioiga faʻalavelave, ma faʻaalia ai o mea faʻapitoa e fesoʻotaʻi ma le kumamotoic acid e manaʻomia ai filifili itu o se tele patino e faʻaalia ai a latou gaioiga faʻaola.
Ona o le auiliiliga o le sootaga o le fausaga ma le gaioiga na faaalia ai o le C9 na suia i le ursonic acid ma le nonyloxy derivative o le ursonic acid (lea e ta'ua i lalo o le KAND 11) o le mea sili ona aoga e taofia ai le tuputupu a'e o la'au, na matou faia ai se fa'amatalaga auiliili o le KAND 11. O le togafitiga o Arabidopsis i le 50 μM KAND 11 na toetoe lava a taofia atoa ai le germination, ae o le maualalo o le fa'aputuga (40, 30, 20, po'o le 10 μM) o le KAND 11 na taofia ai le tuputupu a'e o a'a i se auala e fa'alagolago i le fua (Ata 4a, b). Ina ia fa'ata'ita'i pe a'afia e le KAND 11 le olaola o le meristem o a'a, na matou su'esu'eina ai meristems o a'a na valiina i le propidium iodide (PI) ma fuaina le tele o le vaega o le meristem. O le telē o le meristem o laau toto i luga o se auala e iai le 25 μM KAND-11 e 151.1 ± 32.5 μm, ae o le telē o le meristem o laau toto i luga o se auala fa'atonutonu e iai le DMSO e 264.7 ± 30.8 μm (Ata 4c, d), lea e fa'ailoa mai ai o le KAND-11 e toe fa'afo'isia le gaioiga o le sela. sosolo. Meristem a'a. E ogatasi ma lenei mea, o le togafitiga a le KAND 11 na fa'aitiitia ai le aofa'i o le fa'ailoga o le vaevaega o sela CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS i le meristem a'a (Ata 4e) 17. O nei taunu'uga e fa'ailoa mai ai o le KAND 11 e taofia ai le tuputupu a'e o a'a e ala i le fa'aitiitia o le gaioiga o le fa'ateleina o sela.
Su'esu'ega o le a'afiaga fa'alavelave o urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) i le tuputupu a'e. (a) La'au Col ituaiga vao e 7 aso le matutua ua totoina i luga o MS plates fa'atasi ai ma le maualuga o le KAND 11 ua fa'ailoa mai. Pa fua = 1 cm. (b) Fuainumera o le umi o a'a. O mata'itusi e fa'ailoa mai ai eseesega taua (Tukey HSD test, p< 0.05). n>16. O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia o le averesi ± SD. (c) Confocal microscopy o aʻa Col ituaiga vao ua valiina i le propidium iodide ua totoina i luga o MS plates ma pe leai foi le 25 μM KAND 11. O faʻamau paʻepaʻe e faʻaalia ai le meristem o aʻa. Scale bar = 100 µm. (d) Fuainumera o le tele o le meristem o aʻa (n = 10 i le 11). O eseesega faʻamaumauga na fuafuaina e faʻaaoga ai le t-test (p< 0.05). O pa e fa'atusalia ai le averesi o le lapo'a o le meristem. (e) Su'ega fa'apitoa o le fa'alavelave fa'atusatusa (DIC) o se meristem a'a o lo'o i ai le fausaga CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS ua valiina ma valivali i luga o la'au e 5 aso le matutua ua totoina i luga o ipu MS ma pe leai fo'i le 25 µM KAND assay.
Sa toe tofotofoina le phytotoxicity o le KAND 11 e ala i le faʻaaogaina o se isi laʻau dicotyledonous, o le tapaa (Nicotiana tabacum), ma se meaola tele o le laʻau i le laueleele, o le liverwort (Marchantia polymorpha). E pei o le tulaga o Arabidopsis, o tamaʻi tapaa SR-1 na totoina i luga o le medium o loʻo i ai le 25 μM KAND 11 na maua ai ni aʻa pupuu (Ata 5a). E le gata i lea, e 40 mai le 48 fatu na totogo i luga o ipu o loʻo i ai le 200 μM KAND 11, ae o fatu uma e 48 na totogo i luga o le media na togafitia, o loʻo faʻaalia ai o le maualuga o le maualuga o le KAND sa taua (p< 0.05; chi test -square) na taofia ai le tuputupu aʻe o le tapaa. (Ata 5b). E le gata i lea, o le malosi o le KAND 11 lea na taofia ai le tuputupu aʻe o siama i le liverwort e tutusa ma le malosi aoga i le Arabidopsis (Ata 5c). O nei taunuuga e faʻaalia ai e mafai e le KAND 11 ona taofia le tuputupu aʻe o le tele o laʻau. Ona matou suʻesuʻeina lea o le cytotoxicity e ono mafai ona iai i isi meaola ni vailaʻau e fesoʻotaʻi ma le bear monoamide, e pei o sela HeLa o le tagata ma le Escherichia coli strain DH5α, o ni sui o sela maualuga o manu ma siama. I se faasologa o suʻega o le tuputupu aʻe o sela, na matou matauina ai o le coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, ma le KAND 11 e leʻi aʻafia ai le tuputupu aʻe o sela HeLa poʻo E. coli i le malosi o le 100 μM (Ata 5d,e).
Taofia le tuputupu aʻe o le KAND 11 i meaola e lē o ni Arabidopsis. (a) O tamaʻi tapaʻa SR-1 e lua vaiaso le matutua na totoina i luga o ipu MS ua tu saʻo ma o loʻo i ai le 25 μM KAND 11. (b) O tamaʻi tapaʻa SR-1 e lua vaiaso le matutua na totoina i luga o ipu MS ua tu saʻo ma o loʻo i ai le 200 μM KAND 11. (c) O tamaʻi tapaʻa Tak-1 e lua vaiaso le matutua na totoina i luga o ipu Gamborg B5 faʻatasi ai ma le maualuga o le KAND 11 ua faʻailoa mai. O aū mumu e faʻaalia ai spores na taofia le tuputupu aʻe i totonu o le vaitaimi e lua vaiaso le umi o le faʻasusuina. (d) Suʻega o le tuputupu aʻe o sela o sela HeLa. O le aofaʻi o sela ola na fuaina i taimi faʻatulagaina e faʻaaoga ai se seti faitau sela 8 (Dojindo). I le avea ai ma se faʻataʻitaʻiga, o sela HeLa na togafitia i le 5 μg/ml actinomycin D (Act D), lea e taofia ai le faʻaliliuga o le RNA polymerase ma mafua ai le oti o sela. Na faia suʻesuʻega i le tolu taimi. (e) Suʻega o le tuputupu aʻe o sela E. coli. Na suʻesuʻeina le tuputupu aʻe o le E. coli e ala i le fuaina o le OD600. I le avea ai ma se vaega fa'atonutonu, na togafitia ai sela i le 50 μg/ml ampicillin (Amp), lea e taofia ai le fausiaina o puipui o sela o siama. Na faia su'esu'ega i ni fa'atolu.
Ina ia malamalama i le faiga o le gaioiga o le cytotoxicity e mafua mai i vailaʻau e fesoʻotaʻi ma le uramide, na matou toe iloiloina ai urbenic acid derivatives ma aafiaga faʻalavelave feololo. e pei ona faʻaalia i le ata. E pei ona faʻaalia i Ata 2b, 6a, o laʻau na totoina i luga o agar plates o loʻo i ai le maualuga o le (200 μM) o le urmotonic acid 6 na maua ai ni aʻa pupuu ma piʻo agavale (θ = – 23.7 ± 6.1), ae o laʻau na totoina i luga o le faʻatonutonuina o le medium, o laʻau na maua ai ni aʻa e toetoe lava a saʻo (θ = – 3.8 ± 7.1). O lenei tuputupu aʻe faʻataʻamilomilo e iloa e mafua mai i le le lelei o le cortical microtubules14,18. E ogatasi ma lenei sailiga, o vailaʻau faʻaleagaina o le microtubule disopyramide ma le oryzalin na mafua ai le faʻasolo tutusa o aʻa i lalo o a matou tulaga tuputupu aʻe (Ata 2b, 6a). I le taimi lava e tasi, na matou faʻataʻitaʻiina urmotonic acid derivatives ma filifilia ni nai mea, i nisi o maualuga, na mafua ai le tuputupu aʻe o aʻa faʻataʻamilomilo. O vailaʻau faʻamaʻi 8, 9, ma le 15 na suia ai le itu o le tuputupu aʻe o aʻa i le 75 μM, 50 μM, ma le 40 μM, i le faasologa lava lea, ma faʻaalia ai e mafai e nei vailaʻau ona faʻaleagaina lelei microtubules (Ata 2b, 6a). Na matou faʻataʻitaʻiina foʻi le vailaʻau sili ona malosi o le ursolic acid, KAND 11, i se tulaga maualalo (15 µM) ma maua ai o le faʻaaogaina o le KAND 11 na taofia ai le tuputupu aʻe o aʻa ma o le itu o le tuputupu aʻe o aʻa e le tutusa, e ui lava ina latou faʻasolosolo i le agavale (Ata C3). . Talu ai o le maualuga o le faʻaaogaina o vailaʻau faʻamaʻi microtubule e faʻalavelaveina ai le tuputupu aʻe o laʻau nai lo le mafua ai ona faʻapiʻo aʻa, na matou iloiloina mulimuli ane le avanoa e aʻafia ai e le KAND 11 microtubules e ala i le matauina o cortical microtubules i sela epidermal o aʻa. O le Immunohistochemistry e faʻaaoga ai anti-β-tubulin antibodies i sela epidermal o aʻa o laʻau na togafitia i le 25 μM KAND 11 na faʻaalia ai le mou atu o toetoe lava o cortical microtubules uma i sela epidermal i le elongation zone (Ata 6b). O nei taunuuga e faʻaalia ai o le kumamotonic acid ma ona mea e maua mai ai e galue tuusaʻo pe lē tuusaʻo i luga o microtubules e faʻalavelave ai ma o nei vailaʻau o ni mea fou e taofia ai le microtubule.
O le Ursonic acid ma ona mea e maua mai ai e suia ai cortical microtubules i Arabidopsis thaliana. (a) O le tulimanu o le fa'a'auga o le a'a na fuaina i le i ai o le tele o mea e maua mai ai le urmotonic acid i le maualuga ua fa'ailoa mai. O a'afiaga o vaila'au e lua e iloa e taofia ai microtubules: disopyramide ma oryzalin na su'esu'eina fo'i. O le fa'aopoopoga o lo'o fa'aalia ai le tulaga fa'atonuina e fa'aaoga e fua ai le tulimanu o le tuputupu a'e o le a'a. O fa'ailoga fetu e fa'aalia ai eseesega taua ma togafitiga pepelo (t test, p< 0.05). n>19. Pa fua = 1 cm. (b) Microtubules cortical i totonu o sela epidermal i le sone elongation. O Microtubules i totonu o a'a Arabidopsis Col ituaiga vao na ola i luga o MS plates ma pe leai foi le 25 μM KAND 11 na vaaia e ala i le valiina o le immunohistochemical e fa'aaoga ai β-tubulin primary antibodies ma Alexa Fluor-conjugated secondary antibodies. Pa fua = 10 µm. (c) Fausaga mitotic o microtubules i totonu o le meristem o le a'a. Na vaaia Microtubules e ala i le valiina o le immunohistochemical. O fausaga mitotic, e aofia ai sone prophase, spindles, ma phragmoplasts, na faitauina mai ata confocal. O aū e fa'ailoa mai ai fausaga mitotic microtubule. O fetu e fa'ailoa mai ai eseesega taua ma togafitiga pepelo (t test, p< 0.05). n>9. Pa fua = 50 µm.
E ui o le Ursa e iai le gafatia e faʻalavelave ai le galuega a le microtubule, ae o lona faiga o le gaioiga e faʻamoemoeina e ese mai mea masani e faʻaitiitia ai le polymerization o le microtubule. Mo se faʻataʻitaʻiga, o le maualuga o le faʻateleina o mea e faʻaitiitia ai le polymerization o le microtubule e pei o le disopyramide ma le oryzalin e faʻaosofia ai le faʻalauteleina o sela epidermal, ae leai le KAND 11. E le gata i lea, o le faʻaaogaina faʻatasi o le KAND 11 ma le disopyramide na mafua ai ona tuʻufaʻatasia le tali atu i le tuputupu aʻe o aʻa e mafua mai i le disopyramide ma na matauina le taofia o le tuputupu aʻe e mafua mai i le KAND 11 (Ata S4). Na matou iloiloina foʻi le tali atu o le hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant i le KAND 11. phs1-1 e iai se suiga e le o se tubulin kinase point ma e maua ai ni aʻa pupuu pe a togafitia i le disopyramide9,20. phs1-1 mutant seedlings na totoina i luga o le agar medium o loʻo iai le KAND 11 e pupuu aʻa e tutusa ma na totoina i luga o le disopyramid (ata S5).
E le gata i lea, na matou matauina ni fausaga o le mitotic microtubule, e pei o prophase zones, spindles, ma phragmoplasts, i le root meristem o laau toto na togafitia i le KAND 11. E tusa ai ma matauga mo le CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, na matauina ai se faaitiitia tele o le numera o mitotic microtubules (Ata. .6c).
Ina ia fa'ailoa le cytotoxicity o le KAND 11 i le subcellular resolution, na matou togafitia ai sela fa'asusu BY-2 tapa'a i le KAND 11 ma matauina a latou tali. Na matou fa'aopoopoina muamua le KAND 11 i sela BY-2 o lo'o fa'aalia ai le TagRFP-TUA6, lea e fa'ailogaina ai microtubules i le fluorescent, e iloilo ai le a'afiaga o le KAND 11 i luga o microtubules cortical. Na iloiloina le mafiafia o le microtubule cortical e fa'aaoga ai le au'ili'iliga o ata, lea na fuaina ai le pasene o pixels cytoskeletal i totonu o pixels cytoplasmic. O taunu'uga o le su'ega na fa'aalia ai ina ua mae'a togafitiga i le 50 μM po'o le 100 μM KAND 11 mo le 1 itula, na fa'aitiitia tele le mafiafia i le 0.94 ± 0.74% po'o le 0.23 ± 0.28%, i le fa'asologa, a'o le mafiafia o sela na togafitia i le DMSO, e o'o atu i le 1.61 ± 0.34% (Ata 7a). O nei taunu'uga e ogatasi ma le matauga i le Arabidopsis o le togafitiga a le KAND 11 e fa'aosofia ai le depolymerization o microtubules cortical (Ata 6b). Na matou suʻesuʻeina foʻi le laina BY-2 ma filament actin ua faʻailogaina e le GFP-ABD ina ua maeʻa togafitiga i le tutusa o le malosi o le KAND 11 ma matauina ai o le togafitiga a le KAND 11 na faʻalavelaveina ai filament actin. O togafitiga i le 50 μM poʻo le 100 μM KAND 11 mo le 1 itula na faʻaitiitia ai le mafiafia o le filament actin i le 1.20 ± 0.62% poʻo le 0.61 ± 0.26%, i le faasologa, ae o le mafiafia i sela na togafitia i le DMSO e 1.69 ± 0.51% (Ata 2). 7b). O nei taunuuga e feteenai ma aafiaga o le propyzamide, lea e le afaina ai filament actin, ma le latrunculin B, o se actin depolymerizer e le afaina ai microtubules (SI Ata S6). E le gata i lea, o togafitiga i le coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, poʻo le KAND 11 e le afaina ai microtubules i sela HeLa (SI Ata S7). O le mea lea, e talitonuina o le faiga o le KAND 11 e ese mai le faiga o le cytoskeleton disruptors ua iloa. E le gata i lea, o la matou matauina fa'amikroskopi o sela BY-2 na togafitia i le KAND 11 na fa'aalia ai le amataga o le oti o sela i le taimi o le togafitiga KAND 11 ma fa'aalia ai o le vaega o sela mate na vali lanumoana-lanumoana o Evans e le'i fa'ateleina tele ina ua mavae le 30 minute o le togafitiga KAND 11, ae ina ua mavae le 90 minute o le togafitiga i le 50 μM po'o le 100 μM KAND, o le aofa'i o sela mate na fa'ateleina i le 43.7% po'o le 80.1%, i le fa'asologa (Ata 7c). A tu'ufa'atasia, o nei fa'amaumauga e fa'aalia ai o le ursolic acid derivative KAND 11 o se cytoskeletal inhibitor fa'apitoa i la'au ma se faiga e le'i iloa muamua.
E aʻafia e le KAND microtubules cortical, actin filaments, ma le olaola o sela tapaa BY-2. (a) Vaʻaia o microtubules cortical i sela BY-2 i le i ai o le TagRFP-TUA6. O sela BY-2 na togafitia i le KAND 11 (50 μM poʻo le 100 μM) poʻo le DMSO na suʻesuʻeina e ala i le confocal microscopy. O le mafiafia o le cortical microtubule na fuafuaina mai micrographs o sela tutoʻatasi e 25. O mataʻitusi e faʻaalia ai eseesega taua (Tukey HSD test, p< 0.05). Pa fua = 10 µm. (b) O filo actin cortical i totonu o sela BY-2 na va'aia i luma o le GFP-ABD2. O sela BY-2 na togafitia i le KAND 11 (50 μM po'o le 100 μM) po'o le DMSO na su'esu'eina e ala i le microscopy confocal. O le mafiafia o filo actin cortical na fuafuaina mai micrographs o sela tuto'atasi e 25. O mata'itusi e fa'ailoa mai ai eseesega taua (suega Tukey HSD, p< 0.05). Pa fua = 10 µm. (c) Mata'ituina o sela BY-2 ua mate e ala i le vali lanumoana a Evans. O sela BY-2 na togafitia i le KAND 11 (50 μM po'o le 100 μM) po'o le DMSO na su'esu'eina e ala i le microscopy malamalama. n=3. Pa fua = 100 µm.
O le mauaina ma le faʻaaogaina o oloa fou faanatura ua taitai atu ai i ni alualu i luma taua i vaega eseese o le soifuaga o le tagata, e aofia ai vailaʻau ma faʻatoʻaga. Ua faia suʻesuʻega faasolopito e maua ai ni vailaʻau aoga mai punaoa faanatura. Ae maise lava, o actinomycetes ua lauiloa e aoga o ni vailaʻau faʻamaʻi e teteʻe ai i parasites mo nematodes ona o lo latou gafatia e gaosia ai ni metabolites lona lua eseese e pei o le avermectin, o le vailaʻau autu o le ivermectin ma le bleomycin ma ona mea e maua mai ai, e faʻaaogaina faʻafomaʻi o se vailaʻau e teteʻe ai i le kanesa21,22. E faʻapena foʻi, o le tele o vailaʻau e faʻaumatia ai laʻau ua maua mai actinomycetes, o nisi o ia mea ua uma ona faʻaaogaina faapisinisi1,23. O le mea lea, o le suʻesuʻeina o metabolites o le actinomycete e vavaeʻese ai oloa faanatura ma gaioiga faʻanatura e manaʻomia ua manatu o se fuafuaga lelei. I lenei suʻesuʻega, na matou maua ai se vailaʻau fou, coumamonamide, mai le S. werraensis ma na manuia le faʻapipiʻiina. O le Ursonic acid o se vailaʻau faʻapitoa o le urbenamide ma ona mea e maua mai ai. E mafai ona mafua ai le mimilo o aʻa, faʻaalia ai le gaioiga malosi o laʻau, ma faʻaleagaina tuusaʻo pe le tuusaʻo microtubules o laʻau. Peita'i, o le faiga o le gaioiga a le urmotonic acid atonu e ese mai le faiga o le microtubule inhibitors o lo'o iai nei, talu ai o le KAND 11 e fa'alavelaveina fo'i actin filaments ma mafua ai le oti o le sela, ma fa'ailoa mai ai se faiga fa'atonutonu lea e a'afia ai e le urmotonic acid ma ona mea e maua mai ai le tele o fausaga o le cytoskeletal.
O le fa'amatalaina auiliili atili o le urbenonic acid o le a fesoasoani e malamalama atili ai i le faiga o le gaioiga o le urbenonic acid. Ae maise lava, o le isi sini o le iloiloina lea o le gafatia o le ursonic acid e fusifusia ai microtubules ua fa'aitiitia e iloa ai pe o le ursonic acid ma ona mea e maua mai ai e aoga sa'o i microtubules ma fa'aitiitia ai le polymerization, pe o latou gaioiga e mafua ai le fa'aleagaina o le microtubule. E le gata i lea, i le tulaga e le o se sini tuusa'o microtubules, o le fa'ailoaina o le nofoaga o gaioiga ma sini molecular o le ursonic acid i luga o sela o la'au o le a fesoasoani e malamalama atili ai i meatotino o mea e feso'ota'i ma auala e ono fa'aleleia ai le gaioiga o le herbicidal. O la matou su'ega bioactivity na fa'aalia ai le gafatia tulaga ese o le ursonic acid i le tuputupu a'e o la'au e pei o Arabidopsis thaliana, tapa'a ma liverwort, ae leai se E. coli po'o sela HeLa na a'afia ai. E itiiti pe leai fo'i se oona i sela o manu o se lelei o le ursonic acid derivatives pe afai e atia'e o ni vaila'au fa'asaina mo le fa'aaogaina i fanua fa'ato'aga tatala. O le mea moni, talu ai o microtubules o ni fausaga masani i eukaryotes, o lo latou fa'alavelave fa'apitoa i la'au o se mana'oga autu mo vaila'au fa'asaina. Mo se faʻataʻitaʻiga, o le propyzamide, o se vailaʻau e faʻaitiitia ai le polymerization o le microtubule e pipii saʻo i le tubulin ma taofia ai le polymerization, e faʻaaogaina o se vailaʻau e faʻamamā ai laau ona o lona maualalo o le oona i sela o manu24. E ese mai i le disopyramide, o benzamides e fesoʻotaʻi i ai e eseese tulaga faʻapitoa mo le faʻamoemoega. I le faʻaopoopoga i microtubules o laʻau, o le RH-4032 poʻo le benzoxamide e taofia ai foʻi microtubules o sela o manu poʻo oomycetes, ma o le zalilamide e faʻaaogaina o se vailaʻau e faʻamamā ai laau ona o lona maualalo o le phytotoxicity25,26,27. O le urosa fou na maua ma ona mea e maua mai ai e faʻaalia ai le cytotoxicity filifilia e faasaga i laʻau, ae e taua le maitauina o isi suiga e ono suia ai le tulaga faʻapitoa mo le faʻamoemoega, e ono maua ai ni isi mea e maua mai ai mo le puleaina o fungi pathogenic poʻo oomycetes.
O uiga tulaga ese o le urbenonic acid ma ona mea e maua mai ai e aoga mo lo latou atinaʻeina o ni vailaʻau faʻasaina ma faʻaaogaina o ni meafaigaluega suʻesuʻe. Ua lauiloa lautele le taua o le cytoskeleton i le puleaina o le foliga o sela o laʻau. O suʻesuʻega na muamua atu ua faʻaalia ai ua atiaʻe e laʻau ni faiga faigata o le faʻatulagaina o le cortical microtubule e ala i le puleaina o le microtubule dynamics e pulea lelei ai le morphogenesis. Ua faʻailoa mai le tele o molelaʻau e nafa ma le faʻatonutonuina o le gaioiga a le microtubule, ma o loʻo faʻaauau pea suʻesuʻega e fesoʻotaʻi i ai3,4,28. O lo tatou malamalama i le taimi nei i le microtubule dynamics i sela o laʻau e le o faʻamatalaina atoatoa ai faiga o le faʻatulagaina o le cortical microtubule. Mo se faʻataʻitaʻiga, e ui lava e mafai e le disopyramide ma le oryzalin ona faʻaitiitia le polymerize o microtubules, ae o le disopyramide e mafua ai le faʻaleagaina tele o aʻa ae o le oryzalin e iai sona aafiaga e fai si vaivai. E le gata i lea, o suiga i le tubulin, lea e faʻamautu ai microtubules, e mafua ai foʻi le dextrorotation i aʻa, ae o le paclitaxel, lea e faʻamautu ai foʻi le microtubule dynamics, e leai. O le mea lea, o le suʻesuʻeina ma le faʻailoaina o sini molelaʻau o le ursolic acid e tatau ona maua ai ni malamalamaga fou i le faʻatonutonuina o le cortical microtubules o laʻau. E fa’apena fo’i, o fa’atusatusaga i le lumana’i o vaila’au e aoga i le fa’alauiloaina o le tuputupu a’e fa’aletonu, e pei o le disopyramide, ma vaila’au e le tele se aoga, e pei o le oryzalin po’o le kumamotoric acid, o le a maua ai ni fa’ailoilo i le auala e tupu ai le tuputupu a’e fa’aletonu.
I le isi itu, o toe fa'atulagaina o le cytoskeletal e feso'ota'i ma le puipuiga o se isi lea avanoa e fa'amatala ai le cytotoxicity o le ursonic acid. O le fa'ama'i o se pathogen po'o le fa'aofiina o se elicitor i totonu o sela o la'au e mafua ai ona fa'aumatia le cytoskeleton ma mulimuli ane ai le oti o le sela29. Mo se fa'ata'ita'iga, ua lipotia mai o le cryptoxanthin e maua mai i le oomycete e fa'alavelaveina ai microtubules ma actin filaments a'o le'i oti le sela tapa'a, e tutusa ma le mea e tupu i le togafitiga KAND30,31. O mea tutusa i le va o tali puipuiga ma tali sela e mafua mai i le ursonic acid na mafua ai ona matou manatu o latou te fa'aosofia ai faiga masani o le sela, e ui lava o se a'afiaga vave ma malosi o le ursonic acid nai lo le cryptoxanthin e manino lava. Peita'i, ua fa'aalia e su'esu'ega o le fa'alavelaveina o actin filaments e fa'alauiloa ai le oti fa'afuase'i o le sela, lea e le o taimi uma e o fa'atasi ai ma le fa'alavelaveina o le microtubule29. E le gata i lea, e tatau ona va'ai pe o le pathogen po'o le elicitor e mafua ai le tuputupu a'e o a'a, e pei ona faia e ursonic acid derivatives. O le mea lea, o le malamalama fa'amolecular e feso'ota'i ai tali puipuiga ma le cytoskeleton o se fa'afitauli manaia e tatau ona fo'ia. I le faʻaaogaina o le iai o vailaʻau e maualalo le mamafa o le molecular e fesoʻotaʻi ma le ursonic acid, faʻapea foʻi ma le tele o mea e maua mai i ni malosiaga eseese, e mafai ona latou maua ai avanoa e faʻatatau i ni auala e le o iloa o le sela.
A tuufaatasia, o le mauaina ma le faaaogaina o ni vailaau fou e faatonutonu ai le gaioiga o microtubule o le a maua ai ni metotia malolosi e foia ai faiga faigata o molekula o loo faavae ai le fuafuaina o foliga o sela o laau. I lenei tulaga, o le vailaau fou ua atiaeina o le urmotonic acid, lea e aafia ai microtubules ma actin filaments ma mafua ai le oti o sela, atonu e maua ai se avanoa e malamalama ai i le sootaga i le va o le puleaina o microtubule ma nei isi faiga. O le mea lea, o le auiliiliga o vailaau ma mea tau meaola e faaaoga ai le urbenonic acid o le a fesoasoani ia i tatou e malamalama ai i faiga faatonutonu o molekula e pulea ai le cytoskeleton o laau.
Fa'asusu le S. werraensis MK493-CF1 i totonu o se fagu Erlenmeyer ua fa'apipi'iina i le 500 mL o lo'o i ai le 110 mL o le vaila'au fatu e aofia ai le 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto composition. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) corn extract (KOGOSTCH Co., Ltd., Iapani), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ma le 0.2% CaCO3 i le vai fa'amamago. (pH 7.4 a'o le'i fa'amamāina). O fatu na fa'asusuina i luga o se rotary shaker (180 rpm) i le 27°C mo le 2 aso. O le gaosiga o le gaosiga e ala i le solid state fermentation. O le totoina o fatu (7 ml) na fa'aliliuina i totonu o se fagu K-1 e 500 ml o lo'o i ai le 40 kalama o le vaila'au gaosi e aofia ai le 15 kalama o le karite ua oloina (MUSO Co., Ltd., Iapani) ma le 25 kalama o le vai fa'amamago (e le'i fetu'una'i le pH a'o le'i fa'amamāina). Na faia le fa'afefeteina i le 30°C i le pogisa mo le 14 aso. Na fa'a'esea le mea fa'afefeteina i le 40 ml/fagu EtOH ma fa'asolo i totonu o le ogaumu (1500 kalama, 4°C, 10 minute). O le suāvai fa'atupu (60 ml) na fa'a'esea i se paluga o le 10% MeOH/EtOAc. O le vaega fa'aola sa fa'amamago i lalo o le mamafa fa'aitiitia e maua ai se toega (59.5 mg), lea na faia i le HPLC fa'atasi ai ma le gradient elution (0–10 minute: 90%) i luga o le koluma o le reverse phase (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × length 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minute: 90% H2O/CH3CN i le 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minute: 90% H2O/EtOH, 45–155 minute: 90% H2O/EtOH i le 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 minute: 100% EtOH) i le fua fa'atatau o le 1.5 ml/min, o le coumamonamide (1, 36.0 mg) sa vavae'eseina o se pauta pa'epa'e amorphous.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ tau fuafuaina: 141.0659, tau fuaina: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Na maua fatu o Columbia (Col-0) mai le Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) faatasi ai ma le faatagaga mo le faaaogaina i suesuega. Na totoina ma tausia fatu o le Col-0 i lalo o tulaga o le fale suesue ma faaaogaina o ni laau Arabidopsis vao. Na faamamaina fatu o le Arabidopsis i luga ma totoina i le afa-malosi o le Murashige ma le Skoog medium o loʻo i ai le 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) ma le 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, i le 23 °C ma le malamalama faifai pea. O fatu o le phs1-1 mutant na saunia e T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
O fatu o le ituaiga SR-1 na saunia e T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ma faʻaaogaina o ni laʻau tapaʻa vao. O fatu tapaʻa na faʻamamāina i luga ma faʻasusu i le vai mama mo le tolu po e faʻaleleia ai le tuputupu aʻe, ona tuʻu lea i totonu o se vailaʻau e afa le malosi o loʻo i ai le 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, ma le 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. ma le Skoog medium) ma le pH 5.7 ma faʻatupuina i le 23°C i lalo o le malamalama faifai pea.
O le ituaiga Tak-1 na saunia e T. Kohchi (Iunivesite o Kyoto) ma sa faʻaaogaina o se iunite faʻataʻitaʻi masani mo le suʻesuʻega o le liverwort. Na maua le Gemma mai laʻau faʻatoʻaga ua faʻamamaina ma faʻapipiʻi i luga o le vailaʻau Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) o loʻo i ai le 1% sucrose ma le 0.3% gellan gum ma faʻasusu i le 23°C i lalo o le malamalama faifai pea.
O sela o le tapa'a BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) na saunia e S. Hasezawa (Iunivesite o Tokyo). O sela BY-2 na fa'avaivaia i le 95-fold i le Linsmeier ma le Skoog medium ua suia ma fa'aopoopoina i vaiaso ta'itasi i le 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 . O le fa'asusuina o le sela na fa'afefiloi i luga o se rotary shaker i le 130 rpm i le 27°C i le pogisa. Fufulu sela i le 10 taimi le tele o le medium fou ma toe fa'asusu i le medium lava e tasi. O laina sela transgenic BY-2 o lo'o fa'aalia mautu le microtubule marker TagRFP-TUA6 po'o le actin filament marker GFP-ABD2 i lalo o le cauliflower mosaic virus 35S promoter na gaosia e pei ona fa'amatalaina 33,34,35. O nei laina sela e mafai ona tausia ma fa'afetaui e fa'aaoga ai auala e tutusa ma na fa'aaogaina mo le laina muamua o le sela BY-2.
Sa totoina sela HeLa i le Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) faaopoopo i le 10% fetal bovine serum, 1.2 U/ml penicillin, ma le 1.2 μg/ml streptomycin i totonu o se incubator e 37°C ma le 5% CO2.
O faʻataʻitaʻiga uma o loʻo faʻamatalaina i lenei tusitusiga na faia e tusa ai ma tulafono ma taʻiala a Iapani mo le saogalemu o meaola.
Sa fa'a'asu'uina vaila'au i le dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) o ni vai fa'aputu ma fa'asu'u i le MS medium mo Arabidopsis ma le tapa'a po'o le Gamborg B5 medium mo liverwort. Mo le su'ega o le fa'alavelaveina o le tuputupu a'e o a'a, e silia ma le 10 fatu i le ipu ta'itasi na lūlūina i luga o le agar medium o lo'o i ai vaila'au fa'ailoa po'o le DMSO. Sa fa'ato'aga fatu i totonu o se potu tuputupu a'e mo le 7 aso. Sa pueina ata o la'au ma fuaina le umi o a'a. Mo le su'ega germination Arabidopsis, e 48 fatu i le ipu ta'itasi na lūlūina i luga o le agar medium o lo'o i ai le 200 μM compound po'o le DMSO. Sa totoina fatu Arabidopsis i totonu o se potu tuputupu a'e ma sa faitauina le aofa'i o la'au na totogo i le 7 aso talu ona totogo (dag). Mo le su'ega germination tapa'a, e 24 fatu i le ipu ta'itasi na lūlūina i luga o le agar medium o lo'o i ai le 200 μM KAND po'o le DMSO. Sa totoina fatu tapa'a i totonu o se potu tuputupu a'e ma sa faitauina le aofa'i o la'au na totogo i le mae'a ai o le 14 aso. Mo le suʻega o le taofiofia o le tuputupu aʻe o le liverwort, e 9 embryos mai ipu taʻitasi na tuʻuina i luga o le agar medium o loʻo i ai le maualuga o le KAND poʻo le DMSO ma faʻatoʻaga i totonu o se potu tuputupu aʻe mo le 14 aso.
Faaaoga laau toto ua valiina i le 5 mg/ml propidium iodide (PI) e vaai ai i le faatulagaga o le meristem o a'a. Sa matauina faailoilo PI e ala i le fluorescence microscopy e faaaoga ai le TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).
O le valivali fa'a-histochemical o a'a i le β-glucuronidase (GUS) na faia e tusa ai ma le fa'atulagaga na fa'amatalaina e Malami ma Benfey36. Na fa'amauina la'au i le 90% acetone i le po atoa, valivali i le 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid i le GUS buffer mo le 1 itula ma tu'u i totonu o se vaila'au chloraldehyde fa'asusu. (8 g chloral hydrate, 2 ml vai ma le 1 ml glycerol) ma matauina e ala i le differential interference contrast microscopy e fa'aaoga ai le Axio Imager M1 microscope (Carl Zeiss).
Sa fuaina tulimanu o a'a i luga o laau toto e 7 aso le matutua na totoina i luga o ipu ua tuu sa'o. Fuafua le tulimanu o le a'a mai le itu o le vector kalave e pei ona faamatalaina i le laasaga 6.
O le fa'atulagaga o cortical microtubules na matauina e pei ona fa'amatalaina, fa'atasi ai ma ni nai suiga laiti i le protocol 37. O le anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ma le Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) na fa'aaogaina o ni antibodies muamua ma lona lua i le 1:1000 ma le 1:100 dilutions, i le fa'asologa. Na maua ata o le fluorescence e fa'aaoga ai le TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems). Maua ata o le Z-stack ma fatu ni fa'aaliga maualuga o le malosi e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa.
Sa faia le suega o le tuputupu aʻe o sela HeLa e faʻaaoga ai le Cell Counting Kit 8 (Dojindo) e tusa ai ma faʻatonuga a le kamupani gaosi oloa.
Sa su'esu'eina le tuputupu a'e o le E. coli DH5α e ala i le fuaina o le mafiafia o sela i totonu o le fa'ato'aga e fa'aaoga ai se spectrophotometer i le 600 nm (OD600).
Sa matauina le faatulagaga o le cytoskeletal i totonu o sela transgenic BY-2 e faaaoga ai se microscope fluorescence ua faaauupegaina i se masini suʻesuʻe confocal CSU-X1 (Yokogawa) ma se meapueata sCMOS (Zyla, Andor Technology). Sa iloiloina le mafiafia o le cytoskeletal e ala i le auiliiliga o ata, lea na fuaina ai le pasene o pixels cytoskeletal i totonu o pixels cytoplasmic i ata confocal e faaaoga ai le polokalama ImageJ e pei ona faamatalaina38,39.
Ina ia iloa le oti o le sela i totonu o sela BY-2, o se vaega o le suspension o le sela na fa'afefiloi ma le 0.05% Evans blue mo le 10 minute i le vevela o le potu. O le valiina filifilia o le lanumoana Evans o sela ua mate e fa'alagolago i le fa'aosoina o le vali mai sela ola e le membrane plasma e le'i afaina40. O sela ua valiina na matauina e fa'aaoga ai se microscope bright-field (BX53, Olympus).
Sa totoina sela HeLa i le DMEM fa'aopoopo i le 10% FBS i totonu o se incubator fa'asūsū i le 37°C ma le 5% CO2. Sa togafitia sela i le 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), po'o le 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) mo le 6 itula i le 37°C. Sa fa'amautu sela i le MetOH mo le 10 minute ona fa'amau lea i le acetate mo le 5 minute i le vevela o le potu. Sa fa'afu'afu'a sela fa'amautu i le β-tubulin primary antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ua fa'avaivaia i le 0.5% BSA/PBS mo le 2 itula, fufulu fa'atolu i le TBST, ona fa'afu'afu'a lea i le Alexa Fluor goat antibody. 488 1 itula. – IgG o le isumu (Thermo Fisher Scientific: A11001) ma le 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ua fa'afefiloi i le 0.5% BSA/PBS. A mae'a ona fufuluina i le TBST fa'atolu, ona matauina lea o sela ua valiina i luga o se microscope ua fa'asaga i luga o le Nikon Eclipse Ti-E. Na pu'eina ata i se meapueata Hamamatsu ORCA-R2 CCD ua fa'amālūlūina e fa'aaoga ai le polokalama MetaMorph (Molecular Devices).
Taimi na lafoina ai: Iuni-17-2024