Faafetai mo le asiasi ile Nature.com.Ole lomiga ole su'esu'ega o lo'o e fa'aogaina e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS.Mo fa'ai'uga sili, matou te fautua atu e te fa'aogaina se fa'amatalaga fou o lau su'esu'ega (pe fa'amalo le Faiga Fa'atatau ile Internet Explorer).I le taimi nei, ina ia mautinoa le lagolago faifaipea, o loʻo matou faʻaalia le saite e aunoa ma le siiina poʻo le JavaScript.
O le mauaina ma le fa'aogaina lelei o oloa fa'anatura e mafai ona fesoasoani i le fa'aleleia atili o le olaga o le tagata.O vaila'au fa'asaina o le tuputupu a'e o la'au e fa'aaoga lautele e fai ma fugala'au e pulea ai vao.Ona o le manaʻoga e faʻaaoga ituaiga eseese o herbicides, e manaʻomia le faʻamaonia o mea faʻapipiʻi ma ni auala fou o gaioiga.I lenei suʻesuʻega, na matou maua ai se tala fou N -alkoxypyrrole compound, coumamonamide, mai Streptomyces werraensis MK493-CF1 ma faʻatūina le faʻasologa atoa.E ala i suʻesuʻega faʻaolaola, na matou iloa ai o le urs-monoamic acid o se vailaʻau faʻaogaina o le urs-monoamide ma se mea e mafai.fa'atosina tuputupu a'e laau.E le gata i lea, ua matou atinaʻeina le tele o vailaʻau urbenonic acid, e aofia ai le urbenyloxy derivative (UDA), lea e maualuga le gaioiga o le herbicidal e aunoa ma le afaina ai o le tuputupu aʻe o sela HeLa.Na matou iloa foi o mea e maua mai i le urmotonic acid e faʻalavelaveina microtubules laau;e le gata i lea, o le KAND e aʻafia ai filaments actin ma faʻaosoina le oti;O nei a'afiaga e tele e ese mai a'afiaga o le iniseti microtubule ua iloa ma fautuaina ai se faiga fou mo le ursonic acid, lea e fai ma sui o se aoga taua i le atina'eina o vaila'au fou.
O le mauaina ma le faʻaaogaina o oloa faʻanatura aoga ma a latou mea e maua mai ai o se auala e faʻaleleia ai le lelei o le olaga o le tagata.O metabolites lona lua na gaosia e meaola ninii, la'au ma iniseti ua mafua ai le alualu i luma tele i vailaau ma faatoaga.Ole tele o vaila'au fa'ama'i ma vaila'au fa'ama'i leukemia ua fausia mai mea fa'anatura.E le gata i lea, o ituaiga eseese ovailaau fa'ama'i, fungicides ma herbicides e maua mai i nei mea fa'alenatura mo le fa'aogaina i fa'ato'aga.Aemaise lava, o vailaʻau faʻasaina o vao o ni meafaigaluega taua mo le faʻateleina o fua o faʻatoʻaga i faʻatoʻaga faʻaonaponei, ma o ituaiga faʻafefiloi ua uma ona faʻaaogaina faʻapisinisi.O le tele o gaioiga feavea'i i totonu o la'au, e pei o le photosynthesis, amino acid metabolism, cell wall synthesis, tulafono faatonutonu o mitosis, phytohormone signaling, po'o le protein synthesis, ua manatu o sini masani o herbicides.O pa'u e fa'alavelaveina le fa'aogaina o le microtubule ose vasega masani o vaila'au e a'afia ai le tuputupu a'e o la'au e ala i le a'afiaina o tulafono faatonutonu mitotic2.
Microtubules o vaega ia o le cytoskeleton ma e lautele faʻasaoina i sela eukaryotic.O le tubulin heterodimer e aofia ai le α-tubulin ma le β-tubulin o loʻo fausia ai laina laina microtubule protofilaments, faʻatasi ai ma le 13 protofilaments o loʻo fausia ai se fausaga cylindrical.Microtubules e tele ni matafaioi i sela o laau, e aofia ai le fuafuaina o foliga o le sela, vaevaega o le cell, ma felauaiga intracellular3,4.O sela o laʻau o loʻo i ai microtubules i lalo ole sela o le plasma interphase, ma o nei mea e taʻua o microtubules cortical e manatu e pulea le faʻatulagaina o microfibrils cellulose e ala i le faʻatonutonuina o le cellulose synthase complexes4,5.Cortical microtubules o aʻa epidermal sela, o loʻo i ai i le sone o le vave elongation o le aʻa pito, o loʻo tu i tua, ma cellulose microfibers mulimuli i nei microtubules ma faʻatapulaʻa le itu o le faʻalauteleina o sela, ma faʻateleina ai le faʻalauteleina o le sela anisotropic.O le mea lea, o le microtubule galuega e fesoʻotaʻi vavalalata ma laʻau morphology.Suiga amino acid i genes encoding tubulin mafua ai le skew o cortical microtubule arrays ma le itu tauagavale po o le itu taumatau tuputupu aʻe i Arabidopsis 6,7.E fa'apena fo'i, suiga i microtubule-feso'ota'i polotini e fa'atonutonu microtubule dynamics e mafai fo'i ona ta'ita'iina ai le fa'aletonu o a'a8,9,10,11,12,13.E le gata i lea, o le togafitia o vailaau e fa'alavelaveina ai le microtubule e pei o le disopyramide, e ta'ua fo'i o le pretilachlor, e mafua ai fo'i le tuputupu a'e o a'a i le itu agavale14.O nei faʻamatalaga e faʻaalia ai o le faʻatonuga saʻo o le microtubule e taua tele mo le fuafuaina o le itu o le tuputupu aʻe o laau.
O ituaiga eseese o microtubule inhibitors ua maua, ma o nei vailaʻau ua faia ai se sao taua i suʻesuʻega cytoskeletal, faʻapea foʻi ma faʻatoʻaga ma vailaʻau2.Aemaise lava, oryzalin, dinitroaniline compounds, disopyramide, benzamide-related compounds, ma a latou analogs e mafai ona faʻalavelaveina le gaioiga o le microtubule ma faʻafefe ai le tuputupu aʻe o laau.O le mea lea, e fa'aaogaina lautele e fai ma herbicides.Ae ui i lea, talu ai o microtubules o se vaega taua o sela laau ma manu, o le tele o le microtubule inhibitors e cytotoxic i ituaiga sela e lua.O le mea lea, e ui lava i lo latou faʻaaogaina o herbicides, e faʻatapulaʻaina le numera o vailaʻau antimicrotubule e faʻaaogaina mo faʻamoemoega aoga.
Streptomyces o se ituaiga o le aiga Streptomyces, lea e aofia ai le aerobic, gram-positive, filamentous siama ma e lauiloa lautele mo lona gafatia e gaosia ai le tele o metabolites lona lua.O le mea lea, ua manatu o se tasi o puna sili ona taua o mea fou fa'ale-natura olaola.I le suʻesuʻega o loʻo i ai nei, na matou maua ai se faʻalapotopotoga fou e taʻua o le coumamonamide, lea na vavae ese mai Streptomyces werraensis MK493-CF1 ma S. werraensis ISP 5486. Faʻaaogaina suʻesuʻega faʻapitoa ma suʻesuʻega faʻapitoa atoa, o le fausaga o le coumamonamide na faʻaalia ma lona tulaga tulaga ese N-alkoxypyrrole skeleton. sa tonu.tuufaatasia.O le Ursmonic acid, o se vailaʻau faʻapipiʻi o le ursmonoamide ma ona mea e maua mai ai, na maua e taofia ai le tuputupu aʻe ma le germination o le laʻau faʻataʻitaʻiga lauiloa Arabidopsis thaliana.I se suʻesuʻega faʻatulagaina-gaoioiga sootaga, na matou iloa ai o se tuufaatasiga ma le C9 ua suia i le ursonic acid, e taʻua o le nonyloxy derivative o le ursonic acid (KAND), e matua faʻaleleia ai le faʻalavelave faʻalavelave i le tuputupu ae ma le germination.O le mea mata'ina, o le fa'ato'a maua o le iniseti tuputupu a'e o la'au na a'afia ai fo'i le tupu a'e o le tapaa ma le liverwort ma e le'o cytotoxic i siama po'o sela HeLa.E le gata i lea, o nisi o mea e maua mai i le urmotonic acid e fa'aosoina ai se uiga fa'aletonu o a'a, e fa'ailoa mai ai o nei mea e maua sa'o pe leai fo'i e a'afia ai microtubules.E ogatasi ma lenei manatu, o a matou matauga o microtubules ua fa'aigoaina a le immunohistochemically po'o fa'atasi ai ma polotini fluorescent e fa'ailoa mai ai o le togafitiga KAND e fa'aleaga microtubules.E le gata i lea, o togafitiga faʻatasi ai ma le kumamotonic acid derivatives faʻalavelaveina microfilaments actin.O le mea lea, ua matou mauaina se faʻatoʻaga fou o le tuputupu aʻe o laʻau o lona faʻaogaina tulaga ese e aofia ai le faʻaleagaina o le cytoskeleton.
Strain MK493-CF1 na vavae ese mai le eleele i Shinagawa-ku, Tokyo.Strain MK493-CF1 na fausia ai le mycelium stromal lala lelei.O le vaega fa'asologa o le 16S ribosomal RNA gene (1422 bp) na fuafuaina.O lenei faʻalavelave e talitutusa lava ma S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: faʻalavelave masani, 99.93%).E tusa ai ma lea fa'ai'uga, na fa'amauina ai e feso'ota'i vavalalata lenei galu ma le ituaiga galu o S. werraensis.O le mea lea, matou te fa'aigoa fa'afuase'i lenei galu S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T o lo'o gaosia fo'i ia mea fa'aolaola tutusa.Talu ai e itiiti ni su'esu'ega muamua i le mauaina mai o mea fa'anatura mai lenei meaola ninii, na fa'atino ai nisi su'esu'ega fa'a-kemikolo.Ina ua maeʻa le totoina o le S. werraensis MK493-CF1 i luga o le ala karite e ala i le faʻafefeteina o le malo i le 30 ° C mo le 14 aso, na maua mai ai le ala ile 50% EtOH.60 ml o fa'ata'ita'iga na fa'amamago ina ia maua ai le 59.5 mg o fa'ameamea.O le vaega fa'afefete na tu'uina atu i le fa'afeagai o le HPLC e tu'uina atu ai le N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, igoa coumamonamide, 36.0 mg).Ole aofa'i ole 1 e tusa ma le 60% ole su'ega mama.O le mea lea, na matou filifili ai e suʻesuʻe auʻiliʻili mea totino o le kumamotoamide 1.
O le Coumamonamide 1 o se paʻu paʻepaʻe paʻepaʻe ma faʻamautu maualuga spectrometry (HRESIMS) faʻamaonia C6H8N2O2 (Fig. 1).O le vaega o le pyrrole ua suitulaga i le C2 o lenei tuufaatasiga o loʻo faʻaalia e le δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH i le fusi ole 1H NMR: 4.5 Hz. , H-5) ma le δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ma le fusi o alaleo 13C NMR o loʻo faʻaalia ai le i ai o le fa sp2 carbon atoms.O le i ai o se vaega amide i le tulaga C2 na iloiloina e le HMBC correlation mai le C-3 proton i le amide carbonyl carbon i le δC 161.1.E le gata i lea, o le 1 H ma le 13 C NMR pito i luga i le δH 4.10 (3H, S) ma le δC 68.3 o loʻo faʻaalia ai le i ai o vaega N-methoxy i le mole.E ui o le tulaga sao o le vaega o le methoxy e leʻi faʻamautuina i le faʻaaogaina o suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga e pei o le faʻaleleia o le eseesega o le spectroscopy ma le faʻapuupuuga o le Overhauser faaniukilia (NOEDF), o le N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide na avea ma sui muamua.
Ina ia iloa le fausaga saʻo o le 1, na faia ai se faʻasologa atoa (Fig. 2a).Togafitiga o le 2-aminopyridine 2 o loʻo maua faʻatau faʻatasi ma le m-CPBA na maua ai le N-oxide 3 tutusa i fua faʻatatau.Ina ua uma le 2-aminoazidation o le 2, o le cyclocondensation reaction na faamatalaina e Abramovich na faia i le benzene i le 90 ° C e maua ai le manaʻomia 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 i kalama.Saosaoa 60% (lua vaega).15,16.Methylation ma le hydrolysis o le 4 ona maua ai lea o le 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (ua taʻua o le "cumotonic acid", 6) i fua lelei (70%, lua laasaga).Mulimuli ane, o le amidation e ala i le acid chloride intermediate 6 e faaaoga ai le ammonia vai na maua ai le Kumamoto amide 1 i le 98% fua.O faʻamatalaga faʻamatalaga uma o le 1 faʻapipiʻiina e tutusa ma le vavae ese 1, o lea na faʻamoemoeina ai le fausaga o le 1;
Fa'asologa lautele ma au'ili'iliga o gaioiga fa'aola ole urbenamide ma le urbenic acid.(a) Aofa'i fa'atasi o Kumamoto amide.(b) E fitu aso le matua o le ituaiga vao Arabidopsis Columbia (Col) fatu na totoina i luga o papatusi Murashige ma Skoog (MS) o loʻo i ai le coumamonamide 6 poʻo le coumamonamide 1 i faʻatonuga faʻaalia.Fua fua = 1 cm.
Muamua, matou suʻesuʻeina gaioiga faʻaola o le urbenamide ma ona vaega mo lo latou gafatia e faʻaleleia le tuputupu aʻe o laau.Na matou fa'aopoopoina fa'aputuga 'ese'ese o le ursmonamide 1 po'o le ursmonic acid 6 i le MS agar medium ma fa'atupuina fatu Arabidopsis thaliana i luga o lenei ala.O nei suʻesuʻega na faʻaalia ai o maualuga maualuga (500 μM) o le 6 na faʻalavelaveina le tuputupu aʻe o aʻa (Fig. 2b).O le isi, na matou fa'atupuina fa'asologa eseese e ala i le suia o le N1 tulaga o le 6 ma fa'atino su'esu'ega fa'atulagaina-gaioiga i luga ia i latou (o lo'o fa'amatalaina le fa'asologa fa'atusa i le Fa'amatalaga Lagolago (SI)).O fatu Arabidopsis na totoina i luga o se ala o loʻo i ai le 50 μM ursonic acid derivatives, ma fua le umi o aʻa.e pei ona faaalia i le ata.E pei ona faʻaalia i le Ata 3a, b, ma le S1, o le coumamo acids e eseese umi o laina alkoxy laina (9, 10, 11, 12, ma le 13) poʻo filifili alkoxy tetele (15, 16, ma le 17) i le tulaga N1.O mea na maua mai na faʻaalia ai le faʻalavelave tele o le tuputupu aʻe o aʻa.E le gata i lea, na matou maua ai o le faʻaogaina o le 200 μM 10, 11, poʻo le 17 na faʻalavelaveina le germination (Fig. 3c ma S2).
Suesuega o le fausaga-gaioiga sootaga o le Kumamoto amide ma faʻalapotopotoga faʻapitoa.(a) Fa'atulagaina ma le fa'asologa o mea fa'atusa.(b) Fuafuaga o le umi o a'a o fatu laau e 7-aso le matutua o lo'o toto i luga ole laiga MS fa'atasi ai ma pe leai foi 50 μM coumamonamide.Asterisk o loʻo faʻaalia ai se eseesega tele ma togafitiga faʻafefe (t suʻega, i<0.05).n>18. O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o lona uiga ± SD.nt o lona uiga "e le'i tofotofoina" aua e sili atu i le 50% o fatu e le'i totogo.(c) Fuafuaga o le fua o le totogo o fatu ua togafitia mo le 7 aso i le MS faʻatasi ma pe leai foi le 200 μM coumamonamide ma mea faʻapipiʻi.Fa'ailoga fa'ailoga e fa'ailoa mai ai se eseesega tele ma togafiti fa'afoliga (su'ega chi-square).n=96.
O le mea e mata'ina ai, o le fa'aopoopoina o filifili pito alkyl e umi atu i le C9 na fa'aitiitia ai le gaioiga fa'alavelave, ma fa'ailoa mai e mana'omia e fa'alapotopotoga fa'atatau o le kulimi kumamotoic ni filifili i itu o se lapopo'a e fa'aalia ai a latou gaioiga fa'aletino.
Talu ai ona o le suʻesuʻeina o sootaga faʻavae-gaoioiga na faʻaalia ai na suia le C9 i le ursonic acid ma le nonyloxy derivative o le ursonic acid (lea e taʻua mulimuli ane o le KAND 11) o le faʻatoʻaga sili ona lelei o le tuputupu aʻe o laau, na matou faia ai se faʻamatalaga auiliili o KAND 11. Togafitiga o Arabidopsis faatasi ai ma le 50 μM KAND 11 toetoe lava a taofia atoa le germination, ae o le maualalo o le maualuga (40, 30, 20, po o le 10 μM) o le KAND 11 na taofia ai le tuputupu aʻe o aʻa i se fua faʻatatau (Fig. 4a, b).Ina ia suʻesuʻe pe aʻafia le KAND 11 i aʻa, na matou suʻesuʻeina aʻa meristem ua pisia i le propidium iodide (PI) ma fuaina le tele o le meristem area.O le tele o le meristem o seedlings ola i luga o se ala o loʻo i ai le 25 μM KAND-11 o le 151.1 ± 32.5 μm, aʻo le tele o le meristem o seedlings na ola i luga o se masini faʻatonutonu o loʻo i ai DMSO o le 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d) , lea e taʻu mai ai o le KAND-11 e toe faʻafoʻisia le gaioiga feaveaʻi.salalau.Meristem a'a.E tusa ai ma lenei, KAND 11 togafitiga faʻaitiitia le aofaʻi o le faʻailoga o le vaevaega o sela CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS faʻailoga i le aʻa meristem (Fig. 4e) 17 .O nei fa'ai'uga e fa'ailoa mai ai o le KAND 11 e fa'alavelaveina le tuputupu a'e o a'a e ala i le fa'aitiitia o le gaioiga o le fa'ateleina o sela.
Suʻesuʻega o le faʻalavelave faʻalavelave o mea e maua mai i le urbenonic acid (urbenyloxy derivatives) i luga o le tuputupu aʻe.(a) 7-aso le matutua o le vao-type Col seedlings o lo'o totō i luga ole MS plates fa'atasi ai ma fa'atonuga fa'aalia o le KAND 11. Fua fa'atau = 1 cm.(b) Fuafuaga o le umi o a'a.O mataitusi o lo'o fa'aalia ai le tele o eseesega (su'ega Tukey HSD, i<0.05).n>16. O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia i le uiga ± SD.(c) Confocal microscopy o propidium iodide-pisipisia o vao Col a'a o lo'o tutupu i luga o papatusi MS ma pe leai fo'i le 25 μM KAND 11. O puipui papa'e e ta'u mai ai le meristem a'a.Fua fua = 100 µm.(d) Fuafuaga o le tele o le meristem a'a (n = 10 i le 11).O le eseesega o fuainumera na fuafuaina e ala i le su'ega-t (i<0.05).O fa'amau o lo'o fa'atusalia le lapo'a masani o le meristem.(e) Fa'atusatusaga fa'aeseese fa'alavelave (DIC) fa'ata'ita'iga o se meristem a'a o lo'o iai le fa'aputuga CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS ua pisia ma pisia ile 5-aso le matutua o fatu laau toto i luga o papatusi MS ma pe leai foi se 25 µM KAND suʻega.
O le phytotoxicity o le KAND 11 na toe faʻataʻitaʻiina i le faʻaaogaina o se isi laʻau dicotyledonous, tapaa (Nicotiana tabacum), ma se meaola faʻataʻitaʻiga tele o laʻau, liverwort (Marchantia polymorpha).E pei o le tulaga o Arabidopsis, tapaa SR-1 seedlings totō i luga o le ala o loʻo i ai le 25 μM KAND 11 na maua ai aʻa pupuu (Fig. 5a).E le gata i lea, o le 40 o le 48 fatu na tupu i luga o papatusi o loʻo i ai le 200 μM KAND 11, ae o fatu uma e 48 na faʻatupuina i luga o faʻasalalauga faʻatauemu, e faʻaalia ai o maualuga maualuga o KAND e taua (p<0.05;chi test -square) faʻalavelaveina le faʻatupuina o le tapaa.(Ata 5b).E le gata i lea, o le maualuga o le KAND 11 lea na taofia ai le tuputupu aʻe o siama i le liverwort e tutusa ma le faʻaogaina lelei i Arabidopsis (Fig. 5c).O nei fa'ai'uga ua fa'ailoa mai ai e mafai e le KAND 11 ona fa'alavelaveina le tuputupu a'e o la'au eseese.Ona matou suʻesuʻeina lea o le cytotoxicity o bear monoamide-related compounds i isi meaola, e taʻua o sela HeLa tagata ma Escherichia coli strain DH5α, e fai ma sui o manu maualuga ma siama siama, i le faasologa.I se faʻasologa o suʻesuʻega o le faʻalauteleina o sela, na matou matauina ai o le coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, ma le KAND 11 e leʻi aʻafia ai le tuputupu aʻe o le HeLa poʻo le E. coli sela i faʻamaʻi o le 100 μM (Fig. 5d, e).
Faʻalavelave faʻatupulaia o le KAND 11 i meaola e le o Arabidopsis.(a) O fatu tapaa SR-1 e lua vaiaso le matutua na totō i luga o papatusi MS o loʻo i ai le 25 μM KAND 11. (b) O fatu tapaa SR-1 e lua vaiaso le matutua na totō i luga ole tulaga faʻataʻatia. Papatusi MS o lo'o i ai le 200 μM KAND 11. (c) Lua-vaiaso le matua-ituaiga vao Tak-1 liverwort buds ua ola i luga o ipu Gamborg B5 fa'atasi ai ma fa'atonuga fa'aalia o le KAND 11. O aū mumu e fa'aalia ai spores na taofi le ola i totonu o le lua-vaiaso fa'atosina. vaitaimi.(d) Su'esu'ega fa'ateleina o sela o sela HeLa.O le numera o sela ola na fuaina i taimi faʻatulagaina e faʻaaoga ai se pusa faitau numera 8 (Dojindo).I le avea ai o se faʻatonuga, na togafitia ai siama HeLa i le 5 μg / ml actinomycin D (Tulafono D), lea e taofia ai le RNA polymerase transcription ma mafua ai le oti o le cell.Sa faia su'esu'ega i fa'atolu.(e) su'esu'ega o le fa'ateleina o sela E. coli.E. coli tuputupu aʻe na suʻesuʻeina e ala ile fua ole OD600.I le avea ai o se faʻatonuga, na togafitia sela i le 50 μg/ml ampicillin (Amp), lea e faʻalavelaveina ai le faʻapipiʻiina o puipui sela siama.Sa faia su'esu'ega i fa'atolu.
Ina ia fa'amalamalamaina le faiga o le gaioiga o le cytotoxicity e mafua mai i mea e feso'ota'i ma le uramide, na matou toe su'esu'eina mea e maua mai i le urbenic acid fa'atasi ai ma a'afiaga fa'alavelave.e pei ona faaalia i le ata.E pei ona faʻaalia i Ata 2b, 6a, o laau toto na ola i luga o ipu agar o loʻo i ai maualuga maualuga (200 μM) o le urmotonic acid 6 na maua mai ai aʻa pupuu ma agavale-curved (θ = - 23.7 ± 6.1), ae o fatu laau na ola i luga o le auala faʻatonutonu, o le o fatu laau e toeitiiti lava sa'o a'a (θ = – 3.8 ± 7.1).O lenei uiga tuputupu a'e oblique ua iloa e mafua mai le faaletonu o cortical microtubules14,18.E tusa ai ma lenei sailiga, o le microtubule-destabilizing drugs disopyramide ma le oryzalin na faʻaosoina aʻa tutusa i lalo o tatou tulaga tuputupu aʻe (Fig. 2b, 6a).I le taimi lava e tasi, na matou faʻataʻitaʻiina ai le urmotonic acid derivatives ma filifilia le tele o ia mea, i nisi faʻatonuga, faʻaosofia ai le tuputupu aʻe o aʻa.O mea faʻapipiʻi 8, 9, ma le 15 na suia le itu o le tuputupu aʻe o aʻa i le 75 μM, 50 μM, ma le 40 μM, i le faasologa, e faʻaalia ai o nei mea faʻapipiʻi e mafai ona faʻaleagaina lelei microtubules (Fig. 2b, 6a).Na matou suʻeina foʻi le sili ona malosi o le ursolic acid, KAND 11, i le maualalo o le faʻaogaina (15 μM) ma maua ai o le faʻaogaina o le KAND 11 na faʻalavelaveina ai le tuputupu aʻe o aʻa ma o le itu o le tuputupu aʻe o aʻa e le tutusa, e ui lava na latou faʻasolosolo i le agavale ( Ata C3)..Talu ai ona o le maualuga maualuga o vailaʻau faʻaleagaina microtubule i nisi taimi e taofia ai le tuputupu aʻe o laʻau nai lo le mafua ai o le aʻa o le aʻa, na matou iloiloina mulimuli ane le ono aʻafia ai o le KAND 11 i microtubules e ala i le matauina o microtubules cortical i sela epidermal aʻa.Immunohistochemistry faʻaaogaina anti-β-tubulin antibodies i sela epidermal o aʻa seedling togafitia i le 25 μM KAND 11 na faʻaalia ai le leiloloa o le toetoe lava o microtubules cortical uma i sela epidermal i le sone elongation (Fig 6b).O nei fa'ai'uga ua fa'ailoa mai ai o le kulimi kumamotonic ma ana mea e maua mai ai o lo'o galue tu'usa'o pe leai fo'i i luga o microtubules e fa'alavelave ai ma o nei mea fa'apipi'i o ni mea fa'ainitaneti fou microtubule.
O le Ursonic acid ma ona mea e maua mai e suia ai microtubules cortical i Arabidopsis thaliana.(a) O le fua fa'atatau o a'a o lo'o fua ile iai ole vaila'au ole urmotonic acid ile fa'atonuga fa'aalia.O aʻafiaga o faʻalapotopotoga e lua e iloa e taofia ai microtubules: disopyramide ma oryzalin sa suʻesuʻeina foi.O lo'o fa'aalia i totonu le fa'asologa o lo'o fa'aaogaina e fua ai le maualuga o le tuputupu a'e o a'a.Asterisk o loʻo faʻaalia ai se eseesega tele ma togafitiga faʻafefe (t suʻega, i<0.05).n>19. Fua fua = 1 cm.(b) Cortical microtubules i sela epidermal i le sone elongation.Microtubules i vao-ituaiga Arabidopsis Col aʻa tupu i luga o papatusi MS ma pe leai foi 25 μM KAND 11 sa vaaia i le immunohistochemical staining e faaaoga ai β-tubulin antibodies muamua ma Alexa Fluor-conjugated antibodies lua.Fua fua = 10 µm.(i) Fuafuaga mitotic o microtubules i le a'a meristem.O microtubules na vaʻaia i le faʻaogaina o le immunohistochemical staining.O fausaga mitotic, e aofia ai sone prophase, spindles, ma phragmoplasts, sa faitauina mai ata fefiloi.O aū e faʻaalia ai fausaga microtubule mitotic.Asterisk o loʻo faʻaalia ai se eseesega tele ma togafitiga faʻafefe (t suʻega, i<0.05).n>9. Pa fua = 50 µm.
E ui lava o Ursa e iai le malosi e faʻalavelave ai le microtubule galuega, o lona faiga o gaioiga e faʻamoemoe e ese mai le masani microtubule depolymerizing agents.Mo se faʻataʻitaʻiga, o le maualuga o le maualuga o microtubule depolymerizing agents e pei o le disopyramide ma le oryzalin e faʻaosofia ai le faʻalauteleina o le anisotropic o sela epidermal, ae o le KAND 11 e leai.E le gata i lea, o le faʻaogaina faʻatasi o le KAND 11 ma le disopyramide na mafua ai le tuʻufaʻatasia o le faʻatupuina o aʻa o le aʻa o le disopyramide ma le KAND 11 na faʻatupuina le faʻalavelave tuputupu aʻe na matauina (Fig. S4).Na matou suʻesuʻeina foi le tali a le hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant i le KAND 11. phs1-1 o loʻo i ai se suiga ole tubulin kinase point non-canonical ma maua ai aʻa pupuu pe a togafitia ile disopyramide9,20.phs1-1 fatu mutant na ola i luga o le media agar o loʻo i ai le KAND 11 e pupuu aʻa e tutusa ma aʻa na ola i luga ole disopyramid (fig. S5).
E le gata i lea, na matou matauina le mitotic microtubule structures, e pei o prophase zones, spindles, ma phragmoplasts, i le aʻa meristem o fatu laau na togafitia i le KAND 11. E ogatasi ma faʻamatalaga mo CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS, o se faʻaititia tele i le. na matauina le numera o microtubules mitotic (Fig. 6c).
Ina ia faʻaalia le cytotoxicity o le KAND 11 i le subcellular resolution, matou te togafitia le tapaa BY-2 suspension cell ma KAND 11 ma matauina la latou tali.Na matou faʻaopoopo muamua le KAND 11 i le BY-2 sela o loʻo faʻaalia ai le TagRFP-TUA6, lea o loʻo faʻapipiʻiina ai microtubules, e iloilo ai le aafiaga o le KAND 11 i luga o microtubules cortical.Cortical microtubule density na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le suʻesuʻeina o ata, lea na faʻatatauina le pasene o pixels cytoskeletal i totonu o pixels cytoplasmic.O faʻataʻitaʻiga suʻega na faʻaalia ai ina ua maeʻa togafitiga ma le 50 μM poʻo le 100 μM KAND 11 mo le 1 itula, o le mamafa na faʻaititia tele i le 0.94 ± 0.74% poʻo le 0.23 ± 0.28%, i le faasologa, ae o le mamafa o sela na togafitia i le DMSO, e 1.61 ± 0.34. % (Ata 7a).O nei taunuuga e ogatasi ma le matauina i Arabidopsis o le KAND 11 togafitiga faʻaosoina depolymerization o cortical microtubules (Fig. 6b).Na matou suʻesuʻeina foʻi le laina BY-2 faʻatasi ma le GFP-ABD-labelina filaments actin ina ua maeʻa togafitiga faʻatasi ma le faʻaogaina tutusa o le KAND 11 ma matauina o le KAND 11 togafitiga faʻalavelaveina filaments actin.Togafitiga ma le 50 μM poʻo le 100 μM KAND 11 mo le 1 h na faʻaitiitia ai le mamafa o le filament actin i le 1.20 ± 0.62% poʻo le 0.61 ± 0.26%, i le faasologa, ae o le mamafa i sela na togafitia DMSO o le 1.69 ± 0.52% (Fig.7b).O nei taunuuga e faʻatusatusa i aʻafiaga o propyzamide, lea e le afaina ai filaments actin, ma latrunculin B, o le actin depolymerizer e le afaina ai microtubules (SI Figure S6).E le gata i lea, o togafitiga ma le coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, poʻo le KAND 11 e leʻi aʻafia ai microtubules i sela HeLa (SI Figure S7).O le mea lea, o le faʻaogaina o le KAND 11 e talitonuina e ese mai le faʻalavelave faʻalavelave cytoskeleton.E le gata i lea, o la matou suʻesuʻega faʻapitoa o BY-2 sela na togafitia i le KAND 11 na faʻaalia ai le amataga o le oti o le cell i le taimi o togafitiga KAND 11 ma faʻaalia ai o le vaega o Evans blue-stained cell dead e leʻi faʻatupulaia tele pe a uma le 30 min o KAND 11 togafitiga, ae ina ua maeʻa le 90 minute o togafitiga ma 50 μM poʻo 100 μM KAND, o le numera o sela oti na faʻateleina i le 43.7% poʻo le 80.1%, i le faasologa (Fig 7c).Faʻatasi, o nei faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai o le tala ursolic acid derivative KAND 11 o se vailaʻau faʻapitoa o le cytoskeletal inhibitor faʻatasi ai ma se masini e leʻi iloa muamua.
O le KAND e afaina ai microtubules cortical, filaments actin, ma le gafatia o sela BY-2 tapaa.(a) Va'aiga o microtubules cortical i sela BY-2 i luma o le TagRFP-TUA6.BY-2 sela na togafitia i le KAND 11 (50 μM poʻo 100 μM) poʻo le DMSO na suʻesuʻeina e le microscopy confocal.Cortical microtubule density sa fuafuaina mai micrographs o 25 sela tutoatasi.O mataitusi o lo'o fa'aalia ai le tele o eseesega (su'ega Tukey HSD, i<0.05).Fua fua = 10 µm.(b) Filaments cortical actin i sela BY-2 vaaia i le i ai o le GFP-ABD2.BY-2 sela na togafitia i le KAND 11 (50 μM poʻo 100 μM) poʻo le DMSO na suʻesuʻeina e le microscopy confocal.O le mamafa o filaments cortical actin na fuafuaina mai micrographs o 25 sela tutoatasi.O mataitusi o lo'o fa'aalia ai le tele o eseesega (su'ega Tukey HSD, i<0.05).Fua fua = 10 µm.(c) Su'esu'eina o sela BY-2 ua mate e ala i le fa'ailoga lanu moana a Evans.BY-2 sela na togafitia i le KAND 11 (50 μM poʻo 100 μM) poʻo le DMSO na suʻesuʻeina e le microscopy malamalama.n=3.Fua fua = 100 µm.
O le mauaina ma le faʻaaogaina o oloa fou faʻanatura ua mafua ai le alualu i luma taua i itu eseese o le olaga o le tagata, e aofia ai vailaʻau ma faʻatoaga.Sa fa'atinoina su'esu'ega fa'asolopito e maua mai ai mea aoga mai punaoa faanatura.Aemaise lava, o le actinomycetes e iloa e aoga e pei o antiparasitic antibiotics mo nematodes ona o lo latou gafatia e gaosia ai metabolites lona lua e pei o le avermectin, o le taʻitaʻia o le ivermectin ma le bleomycin ma ona mea e maua mai ai, faʻaaogaina vailaʻau e avea o se vailaʻau faʻamaʻi21,22.E fa'apena fo'i, 'ese'ese vaila'au fa'atosina ua maua mai i le actinomycetes, o nisi o ia mea ua uma ona fa'aogaina fa'apisinisi1,23.O le mea lea, o le auʻiliʻiliga o metabolites actinomycete e faʻamavae ai mea faʻanatura ma gaioiga faʻapitoa e manaʻomia e manatu o se fuafuaga lelei.I lenei suʻesuʻega, na matou maua ai se mea fou, coumamonamide, mai le S. werraensis ma faʻapipiʻiina lelei.O le Ursonic acid o se vailaʻau faʻapipiʻi o le urbenamide ma ona mea e maua mai ai.E mafai ona fa'atupu ai le fa'alili a'a, fa'aalia le feololo i le malosi o le herbicicid, ma fa'aleagaina tu'usa'o pe leai fo'i ni microtubules o la'au.Ae ui i lea, o le faiga o le gaioiga o le urmotonic acid atonu e ese mai i le mea o loʻo i ai nei microtubule inhibitors, talu ai o le KAND 11 e faʻalavelaveina foi filaments actin ma mafua ai le oti o le cell, ma fautua mai ai se faiga faʻatonutonu lea e aʻafia ai le urmotonic acid ma ona mea e maua ai le tele o fausaga cytoskeletal..
O fa'amatalaga auiliili atili ole urbenonic acid o le a fesoasoani e malamalama atili ai ile faiga ole gaioiga ole urbenonic acid.Aemaise lava, o le isi sini o le iloilo lea o le gafatia o le ursonic acid e fusifusia i microtubules faʻaititia e fuafua ai pe o le ursonic acid ma ona mea e maua mai e galue saʻo i luga o microtubules ma faʻamalo i latou, pe o latou gaioiga e mafua ai le faʻaleagaina o le microtubule.E le gata i lea, i le tulaga o microtubules e le o se taulaiga tuusao, o le faailoaina o le nofoaga o le gaioiga ma le mole mole mole o le ursonic acid i luga o sela laau o le a fesoasoani e malamalama atili ai i meatotino o mea e fesoʻotaʻi ma auala e mafai ai ona faʻaleleia le gaioiga o le herbicidal.O la matou su'esu'ega o le bioactivity na fa'aalia ai le tulaga tulaga ese o le cytotoxic o le ursonic acid i luga o le tuputupu a'e o la'au e pei o le Arabidopsis thaliana, tapaa ma le liverwort, ae e le'i afaina E. coli po'o HeLa sela.E la'ititi pe leai foi se o'ona i sela o manu ose tulaga lelei ole ursonic acid e maua mai pe afai e atia'e e fai ma herbicides mo le fa'aogaina i fanua fa'ato'aga.O le mea moni, talu ai o microtubules o fausaga masani i eukaryotes, o la latou faʻalavelave filifilia i totonu o laʻau o se manaʻoga autu mo herbicides.Mo se fa'ata'ita'iga, o le propyzamide, o le microtubule depolymerizing agent e pipii sa'o i le tubulin ma taofia ai le polymerization, o lo'o fa'aaogaina e fai ma herbicide ona o lona maualalo oona i sela o manu24.E ese mai i le disopyramide, o benzamides e feso'ota'i e iai fa'atatau fa'apitoa.I le faaopoopo atu i microtubules laau, RH-4032 poʻo benzoxamide foi faʻalavelaveina microtubules o sela o manu poʻo oomycetes, i le faasologa, ma o le zalilamide e faʻaaogaina e fai ma fungicide ona o le maualalo o le phytotoxicity25,26,27.O le urosa fou na maua ma ana mea e maua mai e faʻaalia ai le cytotoxicity filifilia e faasaga i laʻau, ae e taua le matauina o isi suiga e ono suia ai le faʻamoemoega faʻapitoa, e ono maua ai ni mea faʻaopoopo mo le puleaina o gaʻo pathogenic poʻo oomycetes.
O mea uiga ese o le urbenonic acid ma ona mea e maua mai e aoga mo lo latou atinaʻe e avea ma vailaʻau ma faʻaaogaina e fai ma meafaigaluega suʻesuʻe.O le taua o le cytoskeleton i le puleaina o foliga o laau toto ua lauiloa lautele.O suʻesuʻega muamua na faʻaalia ai o laʻau ua faʻatupuina faiga faʻalavelave o le cortical microtubule faʻalapotopotoga e ala i le puleaina o microtubule dynamics e pulea lelei le morphogenesis.O se numera tele o molelaʻau e nafa ma le faʻatonutonuina o gaioiga microtubule ua faʻamaonia, ma o suʻesuʻega faʻatatau o loʻo faʻaauau pea3,4,28.O lo matou malamalama i le taimi nei o le microtubule dynamics i totonu o sela o laʻau e leʻo faʻamalamalamaina atoatoa le faʻaogaina o le cortical microtubule organization.Mo se faʻataʻitaʻiga, e ui lava e mafai e le disopyramide ma le oryzalin ona faʻaumatia microtubules, o le disopyramide e mafua ai le faʻalavelaveina o aʻa ae o le oryzalin e fai sina aʻafiaga.E le gata i lea, o suiga i le tubulin, lea e faʻamautu ai microtubules, e mafua ai foi le dextrorotation i aʻa, ae o le paclitaxel, lea e faʻamautuina ai le microtubule dynamics, e leai.O le mea lea, o le suʻesuʻeina ma le faʻamaonia o sini mole o le ursolic acid e tatau ona maua ai ni faʻamatalaga fou i le faʻatonutonuina o microtubules cortical laau.E faʻapea foʻi, o faʻatusatusaga i le lumanaʻi o vailaʻau e aoga i le faʻalauiloaina o le tuputupu aʻe faʻalavelave, e pei o le disopyramide, ma vailaʻau faʻaitiitia le aoga, e pei o le oryzalin poʻo le kumamotoric acid, o le a maua ai faʻamatalaga i le auala e tupu ai le faʻalavelave.
I le isi itu, o le toe fetuunaiga o le cytoskeletal e fesoʻotaʻi ma le puipuiga o se isi avanoa e faʻamatalaina ai le cytotoxicity o le ursonic acid.O le fa'ama'i o se fa'ama'i po'o le fa'aofiina o se elicitor i totonu o sela o la'au i nisi taimi e mafua ai le fa'aleagaina o le cytoskeleton ma mulimuli ane mate ai le sela.Mo se faʻataʻitaʻiga, o le oomycete-derived cryptoxanthin ua lipotia mai e faʻalavelaveina microtubules ma filaments actin aʻo leʻi oʻo i le oti o le tapaa, e tutusa ma le mea e tupu ile KAND treatment30,31.O mea tutusa i le va o tali puipui ma tali feaveaʻi e faʻaosoina e le ursonic acid na taʻitaʻia ai i matou e faʻapea latou te faʻaosoina faiga masani telefoni feaveaʻi, e ui lava o se aʻafiaga vave ma sili atu le malosi o le ursonic acid nai lo le cryptoxanthin o loʻo faʻaalia.Ae ui i lea, o suʻesuʻega ua faʻaalia ai o le faʻalavelaveina o filaments actin e faʻateleina ai le oti faʻafuaseʻi, lea e le masani ona faʻatasi ma faʻalavelave microtubule29.E le gata i lea, o loʻo tumau pea le vaʻaia pe o le pathogen poʻo le elicitor e mafua ai le faʻalavelaveina o aʻa, e pei ona faia e ursonic acid derivatives.O le mea lea, o le malamalama mole mole e fesoʻotaʻi ai tali puipui ma le cytoskeleton o se faʻafitauli manaia e tatau ona foia.E ala i le fa'aogaina o le i ai o mea maualalo mole mole mamafa e feso'ota'i ma le ursonic acid, fa'apea fo'i ma le tele o mea e maua mai i le malosi eseese, e ono maua ai avanoa e fa'atatau ai masini feavea'i e le o iloa.
Fa'atasi, o le mauaina ma le fa'aogaina o mea fou e fa'aogaina ai microtubule dynamics o le a maua ai ni auala mamana e fa'atalanoaina ai le lavelave mole mole fa'avae o lo'o fa'avaeina le su'esu'eina o foliga o la'au.I lenei tulaga, o le urmotonic acid faʻapipiʻi talu ai nei, lea e aʻafia ai microtubules ma filaments actin ma faʻaosofia ai le oti o le cell, e mafai ona maua ai se avanoa e faʻamalamalamaina ai le fesoʻotaʻiga i le va o le microtubule control ma isi faiga.O le mea lea, o su'esu'ega fa'ama'i ma meaola e fa'aaoga ai le urbenonic acid o le a fesoasoani ia i tatou e malamalama ai i faiga fa'atonutonu mole mole e pulea le cytoskeleton laau.
Tu'u le S. werraensis MK493-CF1 i totonu o se fagu Erlenmeyer 500 mL o lo'o i ai le 110 mL o fatu fatu e aofia ai le 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% ( w/v) Bacto composition .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w / v) faʻaputu sana (KOGOSTCH Co., Ltd., Iapani), 0.2% (w / v) (NH4) 2SO4 ma 0.2% CaCO3 i le vai deionized.(pH 7.4 a'o le'i fa'amama).O fatu na fa'atupuina i luga o se so'o (180 rpm) i le 27°C mo le 2 aso.Fa'ato'aga fa'ato'aga e ala ile fa'afefeteina.O le aganuʻu fatu (7 ml) na faʻafeiloaʻi i totonu o se fagu 500 ml K-1 o loʻo i ai le 40 g o le gaosiga o gaosiga e aofia ai le 15 g o karite faʻapipiʻi (MUSO Co., Ltd., Iapani) ma le 25 g o vai faʻafefe (pH e le faʻafetaui. a'o le'i fa'ama'iina).).O le faʻafefeteina na faia i le 30 ° C i le pogisa mo le 14 aso.O mea faʻafefeteina na maua mai i le 40 ml / fagu EtOH ma centrifuged (1500 g, 4 ° C, 10 min).O le aganu'u supernatant (60 ml) na maua mai i se fa'afefiloi o le 10% MeOH/EtOAc.O le vaega faʻaletino na faʻafefe i lalo o le faʻaitiitia o le mamafa e maua ai se toega (59.5 mg), lea na faʻaogaina i le HPLC faʻatasi ai ma le gradient elution (0-10 minute: 90%) i luga o se koluma faʻasolosolo (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID. 10 mm × umi 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minute: 90% H2O/CH3CN i le 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minute: 90% H2O/EtOH, 45–155 minute: 90% H2O / EtOH i le 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) i le tafe o le 1.5 ml / min, coumamonamide (1, 36.0 mg) na vavaeeseina o se paʻu paʻepaʻe amorphous.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ tau fuafuaina: 141.0659, fuaina tau: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593–153 cm
O fatu Columbia (Col-0) na maua mai le Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) faʻatasi ai ma le faʻatagaga mo suʻesuʻega.O fatu Col-0 na fa'alauteleina ma tausia i lalo o la matou falesu'esu'e ma fa'aaogaina e fai ma ituaiga vao o Arabidopsis.O fatu Arabidopsis sa fa'amama i luga ma fa'atupuina i le afa-malosi Murashige ma Skoog medium e iai le 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) ma le 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, i le 23 °C ma le malamalama tumau.O fatu o le phs1-1 mutant na saunia e T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
O fatu o le galu SR-1 na saunia e T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ma faʻaaogaina e pei o le vao.O fatu tapaa na fa'amama i luga ma fa'asusu i vai mama mo po e tolu e fa'aleleia ai le germination, ona tu'u lea i totonu o se vaifofo afa-malosi e iai le 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, ma le 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.ma Skoog medium) faʻatasi ai ma le pH 5.7 ma faʻafefe i le 23 ° C i lalo o le malamalama faifaipea.
Strain Tak-1 na saunia e T. Kohchi (Iunivesite Kyoto) ma sa faʻaaogaina e avea ma iunite faʻataʻitaʻi masani mo le suʻesuʻega liverwort.O Gemma na maua mai i la'au fa'amama fa'aleaga ma fa'apipi'i i le Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) o lo'o iai le 1% sucrose ma le 0.3% gellan gum ma fa'asusu i le 23°C i lalo o le malamalama fa'aauau.
tapaa BY-2 sela (Nicotiana tabacum L. cv. Samasama Bright 2) na saunia e S. Hasezawa (Iunivesite o Tokyo).BY-2 sela na faʻafefeteina 95-sauni i suiga Linsmeier ma Skoog medium ma faaopoopo vaiaso ma 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32.O le faʻamalologa o le sela na faʻafefiloi i luga o se mea faʻafefete i le 130 rpm i le 27 ° C i le pogisa.Fufulu sela i le 10 taimi le tele o le ala fou ma toe fa'agata i le ala lava e tasi.BY-2 transgenic cell laina stably faʻaalia le microtubule faʻailoga TagRFP-TUA6 poʻo le faʻailoga filament actin GFP-ABD2 i lalo ole cauliflower mosaic virus 35S promoter na gaosia e pei ona faamatalaina33,34,35.O nei laina sela e mafai ona tausia ma fa'amaopoopo e fa'aoga faiga e tutusa ma na fa'aoga mo le laina telefoni muamua BY-2.
O sela o le HeLa na fa'atupuina i le Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) fa'aopoopo i le 10% fetal bovine serum, 1.2 U/ml penicillin, ma le 1.2 μg/ml streptomycin i le 37°C incubator ma le 5% CO2.
O faʻataʻitaʻiga uma o loʻo faʻamatalaina i lenei tusitusiga na faia e tusa ai ma tulafono faʻapolofesa Iapani ma taʻiala.
O mea fa'afefiloi na fa'amavaeina i le dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) e fai ma vaifofo fa'asoa ma fa'afefeteina i le MS medium mo Arabidopsis ma tapaa po'o Gamborg B5 medium mo liverwort.Mo le su'esu'eina o le fa'alavelaveina o le tuputupu a'e o a'a, e sili atu i le 10 fatu i le ipu ta'itasi na totōina i luga o le medium media o lo'o i ai mea fa'apitoa po'o DMSO.O fatu e faʻatumauina i totonu o se potu tuputupu aʻe mo le 7 aso.Na pu'eina ata ma fua le umi o a'a.Mo su'esu'ega germination a Arabidopsis, e 48 fatu i le ipu ta'itasi sa lūlūina i luga o le medium media o lo'o iai le 200 μM compound po'o le DMSO.O fatu Arabidopsis na totoina i totonu o se potu tuputupu ae ma faitau le aofaʻi o fatu toto e 7 aso talu ona tupu (dag).Mo le su'esu'eina o le fa'atupuina o tapaa, e 24 fatu i le ipu ta'itasi sa lūlūina i luga o le ala o le agar o lo'o iai le 200 μM KAND po'o le DMSO.O fatu tapaa sa toto i totonu o se potu tuputupu a'e ma faitau le aofa'i o fatu ua totogo pe a uma le 14 aso.Mo le su'esu'ega o le fa'aitiitia o le tuputupu a'e o le ate, e 9 embryos mai ipu ta'itasi na fa'apipi'iina i luga o le agar medium o lo'o i ai fa'atonuga fa'aalia o le KAND po'o le DMSO ma fa'asusu i totonu o se potu tuputupu a'e mo le 14 aso.
Fa'aoga fatu laau ua pisia i le 5 mg/ml propidium iodide (PI) e va'aia ai le fa'aputuga o le meristem a'a.O faailoilo PI na matauina e le microscopy fluorescence e faʻaaoga ai le TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).
O le staining histochemical o aʻa i le β-glucuronidase (GUS) na faia e tusa ai ma le faʻasalalauga faʻamatalaina e Malami ma Benfey36.O fatu na faʻapipiʻiina i le 90% acetone i le po, faʻapipiʻiina i le 0.5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid i le GUS buffer mo le 1 itula ma tuʻu i totonu o se vaifofo chloraldehyde vai.(8 g chloral hydrate, 2 ml vai ma 1 ml glycerol) ma matauina i le eseesega faʻalavelave faʻatusatusa microscopy e faʻaaoga ai le microscope Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sa fuaina pito o a'a i luga o fatu laau e 7 aso le matutua o lo'o totō i luga o papatusi tu'u sa'o.Fua le tulimanu o le a'a mai le itu o le kalave e pei ona faamatalaina i le Laasaga 6.
O le faʻatulagaina o microtubules cortical na matauina e pei ona faʻamatalaina, faʻatasi ai ma suiga laiti i le protocol 37.Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ma Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) na faʻaaogaina e avea ma antibodies muamua ma lona lua i 1: 1000 ma 1: 100 dilutions, taitasi.Na maua ata o le fluorescence i le fa'aaogaina o le TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).Maua ni ata Z-stack ma fai fa'ata'ita'iga sili ona maualuga e tusa ai ma fa'atonuga a le gaosi oloa.
Na fa'atinoina le su'esu'ega o le fa'atuputeleina o le cell HeLa e fa'aaoga ai le Cell Counting Kit 8 (Dojindo) e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa.
O le tuputupu aʻe o le E. coli DH5α na suʻesuʻeina e ala i le fuaina o le cell density i le aganuu e faʻaaoga ai se spectrophotometer i le 600 nm (OD600).
Cytoskeletal faʻalapotopotoga i le transgenic BY-2 sela na matauina i le faʻaogaina o se microscope fluorescence faʻapipiʻiina i se masini suʻesuʻe faʻafefe CSU-X1 (Yokogawa) ma se mea pueata sCMOS (Zyla, Andor Technology).Cytoskeletal density na suʻesuʻeina e ala i le suʻesuʻeina o ata, lea na faʻatatauina le pasene o pixels cytoskeletal i totonu o pixels cytoplasmic i ata faʻafefeteina e faʻaaoga ai le ImageJ software e pei ona faamatalaina38,39.
Ina ia iloa le oti sela i BY-2 sela, o se aliquot o le taofiga sela na incubated i le 0.05% Evans lanumoana mo 10 minute i le vevela potu.Filifilia Evans lanu lanumoana o sela mate e fa'alagolago i le fa'auluina o le vali mai sela ola e ala i le membrane plasma le atoatoa40.O sela pisia na matauina i le faʻaaogaina o se microscope malamalama (BX53, Olympus).
O sela HeLa na tupu i le DMEM faʻaopoopo i le 10% FBS i totonu o se incubator faʻamaʻa i le 37 ° C ma le 5% CO2.O sela na togafitia i le 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), poʻo le 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) mo le 6 h i le 37 ° C.Na faʻapipiʻi sela i le MetOH mo le 10 min ona faʻatasi ai lea ma le acetate mo le 5 min i le vevela o le potu.O sela faʻamau na faʻapipiʻiina i le β-tubulin antibody matua (1D4A4, Proteintech: 66240-1) faʻafefe i le 0.5% BSA / PBS mo le 2 itula, fufuluina 3 taimi i le TBST, ona faʻapipiʻi lea i le Alexa Fluor goat antibody.488 1 itula.- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ma le 15 ng / ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) faʻafefe i le 0.5% BSA / PBS.Ina ua uma ona fufulu i le TBST faatolu, na matauina sela pisia i luga o le Nikon Eclipse Ti-E microscope liliu.Na pu'eina ata i se mea pu'eata a Hamamatsu ORCA-R2 CCD fa'aoga le polokalama MetaMorph (Molecular Devices).
Taimi meli: Iuni-17-2024